华山松大小蠹肠道微生物群落多样性与幼虫肠道纤维素降解菌的研究毕业论文

1、华山松大小蠹肠道微生物群落多样性与幼虫肠道纤维素降解菌的研究毕业论文 分类号： 学校代码：XXX U D C： 研究生学号：XXX 密 级： XXX届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文 华山松大小蠹肠道微生物群落多样性与幼虫肠道纤维 素降解菌的研究 学科专业： 野生动植物保护与利用 研究方向： 森林昆虫学 研 究 生： XXX 指导教师： XXX 教授 完成时间： XXX年4月 中国 陕西 XXX University code: XXX UDC: Postgraduate number: XXX Dissertation for Doctor Degree Northwest A GUT-A

2、SSOCIATED MICROBIOTA DIVERSITY OF THE WHITE PINE BEETLE (DENDROCTONUS ARMANDI) AND CELLULOLYTIC MICROBIAL COMMUNITY IN ITS LARVAL GUT Major: Wildlife conservation and utilization Research field: Forestry Entomology Name of Postgraduate: Hu Xia Adviser: Prof. Chen Hui Date of submitted: April, XXX Ya

3、ngling Shaanxi China 华山松大小蠹肠道微生物群落多样性与 幼虫肠道纤维素降解菌的研究 摘 要 华山松大小蠹（Dendroctonus armandi Tai and Li）作为中国秦岭巴山地区最为重要的森林害虫，严重危害森林健康和生态系统的稳定性。目前对其肠道微生物的群落结构和多样性知之甚少，本研究结合巢式PCR-DGGE、克隆测序、ARDRA、SDS-PAGE和native-PAGE技术对华山松大小蠹肠道微生物群落结构和多样性，以及幼虫肠道纤维素降解菌进行了系统的研究，主要研究结果如下： 1. 利用巢式PCR-DGGE技术分析了华山松大小蠹幼虫、蛹、雌雄成虫消化道内细菌的

4、群落结构、多样性及其动态变化。结果表明：华山松大小蠹肠道微生物群落结构相对简单且随着发育阶段不同而发生改变，雌雄成虫的细菌群落组成差异不显著（P>0.05）；柠檬酸杆菌（Citrobacter）是华山松大小蠹幼虫、雌雄成虫肠道细菌群落的主要组分，尤其是在雌性成虫肠道细菌群落中更显优势，占细菌群落总数的80%，而蛹期甲基杆菌（Methylobacterium）占细菌群落总数的56%，为优势种群。基于Citrobacter的固氮性和Methylobacterium参与碳循环等，可以推测华山松大小蠹肠道细菌Citrobacter和Methylobacterium与华山松大小蠹的发育和营养利用密

5、切相关。 2. 利用真菌18S rRNA区域PCR扩增与DGGE技术研究了华山松大小蠹坑道、幼虫、蛹、雌雄成虫消化道内的真菌群落。结果表明：华山松大小蠹不同发育期肠道内的真菌群落多样性指数均表现出显著差异（P<0.05）；酵母菌中的假丝酵母（Candida）是华山松大小蠹坑道、幼虫、蛹和雌雄成虫期的优势种群，尤其是在蛹期肠道真菌群落组成中更为明显，占真菌群落总数的56%，而华山松大小蠹共生蓝变真菌（长喙壳属Ophiostoma）则是华山松大小蠹坑道、幼虫、蛹和雌雄成虫期丝状真菌群落组成的最高组分。华山松大小蠹的肠道真菌大多与其消化机制、解毒机制以及信息素合成相关。 3. 通过以羧甲基纤维

6、素钠作为唯一碳源和干果红染色法，从华山松大小蠹幼虫肠道中筛选出91株纤维素降解细菌，通过ARDRA分型为11类，对各类细菌进行形态和分子鉴定的结果显示：幼虫肠道纤维素降解菌主要是由-变形菌纲（73.6%）、-变形菌纲（8.8%）和厚壁菌门（17.6%）的细菌组成，其中-变形菌纲肠杆菌科沙雷氏菌属（Serratia）是华山松大小蠹肠道可培养细菌中最重要的纤维素降解菌，占总纤维素降解菌的49.5%，假单胞菌（Pseudomonas）占总纤维素降解菌的22%。本研究首次发现短波杆菌（Brevundimonas kwangchunensis）、泡囊短波单胞菌（B. vesicularis）、甲基杆菌（

7、M. populi）和假黄色单胞菌（Pseudoxanthomonas mexicana）具有纤维素降解活性。 4. 通过形态和分子鉴定，证实了华山松大小蠹幼虫肠道纤维素降解真菌即为华山松大小蠹体外共生真菌秦岭细粘束孢（Leptographium qinlingensis），表明华山松大小蠹幼虫肠道的秦岭细粘束孢由成虫体外携带，经幼虫取食而进入肠道。 5. 通过硫酸铵分级沉淀和DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化得到秦岭细粘束孢的漆酶蛋白，在SDS-PAGE和native-PAGE图谱中仅显示一个条带，为单一蛋白，分子量61 kDa，米氏常数15.3 ?M，最大反应速度372.9 U/mg。此外，

8、1 mM和10 mM的Cl-、SO42-、NO3-对秦岭细粘束孢的漆酶活性影响不显著（P>0.05），而100 mM的 Cl-和NO3-离子对漆酶活性具有显著的抑制作用（P<0.05）。 本研究从华山松大小蠹肠道微生物的丰度、种群结构、群落功能多样性等方面探索了华山松大小蠹肠道微生物对华山松大小蠹的营养消化、发育和解毒机制的影响，研究结果丰富了华山松大小蠹肠道微生态、华山松大小蠹与微生物的内在关系，为华山松大小蠹的种群动态和纤维素的营养利用，及其综合治理提供了理论依据。 关键词：华山松大小蠹；微生物群落；巢式PCR-DGGE；纤维素酶；漆酶 GUT-ASSOCIATED MICRO

9、BIOTA DIVERSITY OF THE WHITE PINE BEETLE (DENDROCTONUS ARMANDI) AND CELLULOLYTIC MICROBIAL COMMUNITY IN ITS LARVAL GUT ABSTRACT The Chinese white pine beetle, Dendroctonus armandi Tsai and Li, is arguably the most destructive forest insect in the Qinling Mountains in Northern China. Little is known

10、about the structure of the microbial communities associated with D. armandi, even though this wood-boring insect plays important roles in ecosystem and biological invasion processes that resulted in huge economic losses in pine forests. In this work, nested PCR-DGGE, clone sequencing, ARDRA, SDS-PAG

11、E and native-PAGE were employed to investigate the composition and the roles of the microbial communities present in the guts of D. armandi at different developmental stages. The main points of this dissertation are listed as follows: 1. Analysis of PCR-amplified 16S rRNA gene fragments of bacteria

12、from the guts of D. armandi larvae, pupae, as well as male and female adults revealed low complexity of bacterial communities which differed according to the developmental stage. Citrobacter spp. and Pantoea spp. predominated in larvae and adults, whereas Methylobacterium was the dominant genus at t

13、he pupal stage (56%). The main difference between the guts of male and female adults was the greater dominance of Citrobacter in females (80%). These results suggested that the bacterial community associated with D. armandi guts may influence the development of insect. 2. Analysis of PCR-amplified 1

14、8S rRNA gene fragments of fungi from the guts of D. armandi larvae, pupae, male and female adults and their galleries in Pinus armandi revealed low complexity of fungal communities which differed according to the developmental stage. Yeast of the genus Candida and filamentous fungal Ophiostoma predo

15、minated in guts and galleries of D. armandi. In particular, Candida accounted for 56% in the pupal stage, which was related to lipolysis and might support pupae physiological activities. The fungal community in D. armandi guts represented one of the factors that may interfere with insect development

16、. 3. A total of 91 cellulolytic bacteria were isolated and assigned to 11 genotypes using amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) in the intestine of D. armandi larvae. Partial 16S rDNA sequence analysis and morphological tests were used to assign the 11 representative isolates. The res

17、ults showed that the isolates belonged to -Proteobacteria, -Proteobacteria and Firmicutes. Members of -Proteobacteria were the most frequently represented species and accounted for 73.6% of all the cellulolytic bacteria. The cellulolytic bacteria in D. armandi larva gut were mainly identified as Ser

18、ratia, accounted for 49.5%, followed by Pseudomonas, which accounted for 22%. In addition, members of Bacillus, Brevundimonas, Paenibacillus, Pseudoxanthomonas, Methylobacterium and Sphingomonas were found in the D. armandi larva gut. Brevundimonas kwangchunensis, B. vesicularis, M. populi and P. me

19、xicana were firstly reported to be cellulolytic in this study. 4. Only one type of cellulolytic fungus was isolated and identified as Leptographium qinlingensis by Partial ITS rDNA sequence analysis and morphological tests. 5. The laccase secreted by the most important symbiotic fungus of D. armandi

20、, L. qinlingensis, are involved in lignin degradation to provide utilizable nutrition for D. armandi, and catalyze some biochemical reactions, causing the damages of tree tissue. In present study, the purity of the laccase was confirmed by SDS-PAGE and native-PAGE and the apparent molecular mass was

21、 61.0 kDa. The catalytic efficiencies Km and Vmax determined by substrate guaiacol were 15.4 M and 372.9 U/mg, respectively. Moreover, it was found that 1 mM and 10 mM Cl-, SO42-, NO3- showed no significant influence (P>0.05) on the laccase activity, while, 100 mM acid radical ions resulted in si

22、gnificant inhibition (P<0.05) on the enzyme activity except for 100 mM SO42- (P>0.05). The data obtained in this study, regarding the phylogenetic relationships and the community structure of intestinal microbia at different developmental stages of the D. armandi life cycle, will contribute to

23、 our understanding on D. armandi and the biology role of the intestinal microbia, which might provide an opportunity and theoretical basis to promote integrated pest management (IPM) of D. armandi. KEY WORDS: Dendroctonus armandi, microbial community, nested PCR-DGGE, cellulase, laccase 目 录 第一章 文献综述

24、 10 1.1华山松大小蠹 10 1.2昆虫与肠道微生物 11 1.2.1研究概况 11 1.2.2昆虫肠道细菌多样性 12 1.2.3昆虫肠道真菌多样性 15 1.3昆虫肠道微生物研究方法 16 1.3.1稀释涂布平板法 16 1.3.2 分子杂交技术 17 1.3.3 核苷酸测序技术 18 1.4研究内容和目的意义 25 1.4.1 研究目的与意义 25 1.4.2 研究内容 25 1.4.3 技术路线 26 第二章 华山松大小蠹肠道细菌群落的多样性 27 2.1样品采集 27 2.1.1 试验采样地概况 27 2.1.2 样品采集 28 2.1.3 前期处理 28 2.1.4 主要器材及

25、试剂 29 2.2试验方法 29 2.2.1 肠道细菌总DNA提取 29 2.2.2 巢式PCR 30 2.2.3 变性梯度凝胶电泳DGGE 30 2.2.4 克隆转化 32 2.3数据处理 32 2.3.1 系统发育树的构建 33 2.3.2 DGGE图谱分析 33 2.3.3多样性指数分析 33 2.3.4运算分类单位（OTU）及多样性分析 34 2.4试验结果与分析 34 2.4.1 巢式PCR的结果检测 34 2.4.2华山松大小蠹不同发育阶段细菌群落结构多样性分析 35 2.4.3聚类分析和优势菌属 36 2.4.4运算分类单位（OTUs） 39 2.4.5细菌群落结构分析 40 2

26、.5小结 41 第三章 华山松大小蠹肠道真菌群落的多样性 43 3.1样品采集 43 3.1.1 试验采样地概况 43 3.1.2 样品采集 43 3.1.3 前期处理 43 3.1.4 主要器材及试剂 43 3.2试验方法 44 3.2.1真菌总DNA提取 44 3.2.2 巢式PCR 44 3.2.3 变性梯度凝胶电泳DGGE 45 3.3数据处理 45 3.4试验结果与分析 45 3.4.1 巢式PCR 46 3.4.2 DGGE 46 3.4.3 DGGE图谱分析 47 3.4.4 OTUs 48 3.5讨论 51 3.5.1华山松大小蠹肠道真菌群落多样性分析 51 3.5.2真菌群落

27、结构 51 3.5.3优势菌种分析 52 3.5.4生物防治 53 3.6小结 53 第四章 华山松大小蠹肠道产纤维素细菌的筛选与鉴定 54 4.1样品采集 55 4.1.1 试验采样地概况 55 4.1.2 样品采集 55 4.1.3 前期处理 55 4.1.4 对照菌株 55 4.1.5 主要器材及试剂 55 4.2试验方法 56 4.2.1 CMC降解细菌的筛选与计数 56 4.2.2 细菌CMCase活性测定 57 4.2.3 ARDRA 57 4.2.4 聚类分析 58 4.2.5 OTU 59 4.2.6 细菌形态鉴定 59 4.2.7 真菌形态鉴定 62 4.2.8 真菌分子鉴定

28、 62 4.3试验结果与分析 63 4.3.1 华山松大小蠹幼虫纤维素降解细菌菌落计数 63 4.3.2 产CMCase细菌菌株分离与鉴定 64 4.3.3 产CMCase细菌群落分析 67 4.3.4 产CMCase真菌形态鉴定 67 4.3.5 真菌分子鉴定 68 4.4讨论 69 4.5 小结 71 第五章 秦岭细粘束孢漆酶纯化与酶学特性 72 5.1 试验材料 73 5.1.1供试菌种 73 5.1.2 主要器材及试剂 74 5.2试验方法 74 5.2.1 部分纯化的漆酶SDS-PAGE分析 74 5.2.2 部分纯化的漆酶native-PAGE分析 76 5.2.3 酶动力学分析

29、76 5.2.4 酸根阴离子对漆酶活性的影响 76 5.3数据处理 76 5.4试验结果与分析 76 5.4.1 漆酶蛋白分子量测定和纯化分析 76 5.4.2 酶动力学性质分析 77 5.4.3 酸根阴离子对漆酶活性的影响 77 5.4.4讨论 77 5.5小结 78 第六章 总结 79 6.1创新之处 错误！未定义书签。 6.2 研究结论 错误！未定义书签。 6.3 研究展望 错误！未定义书签。 参考文献 81 附录1 错误！未定义书签。 附录2 错误！未定义书签。 附录3 错误！未定义书签。 附录4 错误！未定义书签。 缩略词 错误！未定义书签。 致 谢 错误！未定义书签。 作者简介 错

30、误！未定义书签。 第一章 文献综述 1.1华山松大小蠹 小蠹虫作为世界性森林害虫，最初以独立类群被纳入小蠹科（Scolytidae）（Wood 1982），而后在最新分类系统中将其并入象甲科（Curculionidae），小蠹亚科（Scolytidae）（Oberprieler et al. 2007; 卜书海 2011）。目前小蠹亚科分为181个属， 6000余种，绝大多数以危害针叶树木为主 （Oberprieler et al. 2007; Wood 1982）。全球每年因小蠹虫危害森林导致的经济损失高达十亿美元以上（Wood 1982; Christiansenet al. 1987）。因此长期以来许多国家和地区将小蠹虫作为最重要的森林害虫，也成为研究和防治的重点（尤其在北美、欧洲和亚洲等小蠹虫频发重灾区）（Christiansen et al. 1987; 段焰青等 2006）。 华山松大小蠹（Dendroctonus armandi