动物细胞培养技术

1、、大纲细胞培养之动物培养技术1 动物细胞的特点及生长特性2 固定化动物细胞大规模培养技术2.1 吸附2.1.1 多孔陶瓷2.1.2 微载体2.2 包埋3 动物细胞的灌注培养方法3.1 阶段培养3.1.1 pH 值阶段培养3.1.2 溶氧阶段培养3.1.3 化学试剂诱导阶段培养3.2 代谢调控培养3.2.1 控制葡萄糖浓度法3.2.2 控制谷氨酰胺法3.2.3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法3.2.4 代谢产物的去除4 动物细胞无血清培养技术5 其它方法：改变细胞特性二、合作者名单陈靖 方丽娜 孙琼花 黄丽京 洪燕卿 翁桂琴 杨金龙三、主要参考文献1 翟中和 细胞生物学 北京 : 高等教育出版社 200

2、7.8.3 .70-722 邹寿长 李干祥 杨葆生 徐秀英 大规模动物细胞培养技术研究进展 生命科学研究 第 5 卷第 2 期 2001 年 6 月3 忻亚娟 动物细胞培养技术的进展 浙江预防医学 2001 年第 14 卷第 2 期动物细胞培养技术动物细胞培养开始于上世纪初，1962 年其规模开始扩大 , 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法 , 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、 生长因 子、疫苗和单抗等生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的 50% 。动物细胞培养技术 水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、 优化细胞培养环境、 改变细胞特性、 提高产 品的产

3、率与保证其中质量上。1 动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样 , 在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养 , 但 其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多无细胞壁 , 机械强度低 , 对剪切力敏感 , 适应环境能力差； 倍增时间长 , 生长缓慢 , 易受 微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，生产成本高 ， 但附加值也高。2固定化动物细胞大规模培养技术在动物细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活力，更重要的是利用细胞来合成和分泌

4、蛋白，因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性，因此应考虑使用较温和的固定化方法 ，如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。2.1 吸附2.1.1 多孔陶瓷美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生 物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体，可提供4.25 m2的生长表面积。既可用于培养悬浮生长的细胞，又可用于培养贴壁依赖性细胞。该系统可以连续化生产蛋白质。由于产物直接分泌到培养基中，给分离纯化带来方便。而且细胞不用从 培养基中分离，所以不必考虑梯度问题；当培养基高速循环时，可以保持相对恒定的营养物 和氧浓度。增加套数即可

5、实现放大。2.1.2微载体微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒（微载体），使细胞在微载体表面附着和生长，并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面 ，1g微载体其比表面积可达 6000 mf,从而可实现细胞的高 密度培养。2.2包埋将动物细胞包埋在各种多聚物多孔载体中而制成固定化动物细胞的方法称为包埋法。 此法步骤简便，条件温和，负荷量大，细胞泄露少。因细胞嵌入在高聚物网格中而受到保护 细胞能抗机械剪切。但该法也有一定缺点，如扩散限制，并非所有细胞都处于

6、最佳营养物浓 度。包埋法一般适用于非锚地依赖型细胞的固定化。多孔凝胶是最常用的载体，用于动物细胞固定化的凝胶主要有海藻酸钙、琼脂糖、血纤维蛋白等。3动物细胞的灌注培养方法灌注培养技术的出现，为动物细胞高密度大规模培养开辟了广阔的前景。此法已成为动物细胞大规模培养的主要方法。在灌注培养中，细胞保留在反应器系统中，收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营 养成分，并可带走代谢产物，同时细胞保留在反应器系统中，可以达到很高的细胞密度。同 其他方法相比，灌注培养的产率可以提高一个数量级，并可大大降低劳动力消耗。在灌注培养前，对动物细胞的生长和生理特性

7、进行充分的考察 ，是十分必要的，能为灌 注培养提供有益的参考。灌注培养可以从两个方面入手，一是改变动物细胞的培养环境，实 行阶段培养；二是进行代谢调控。3.1 阶段培养一般认为，动物细胞的培养条件应尽量模拟来源动物体内的条件，而且在培养中通常保持不变。而实际上，每种细胞的最适生长条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法培养就是根据这一点，把培养过程分为细胞生长期和产物生成期，分别采取不同的培养条件，以达到在细胞生长期使接种细胞大量繁殖，提高比生长速率，尽快获得高密度细胞；在产物生成期保持细的高密度，维持存活率，降低细胞死亡速率，持续获得高产率蛋白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时，阶段培养尤见优势

8、。具体说来 ，可以用以下方法。3.1.1 pH值阶段培养对大多数动物细胞，培养液中合适的PH为7.2 7.4。低于6.8或高于7.6对细胞的生长都不利。近年来，对胞内PH的研究比较活跃。实验发现胞内PH对细胞的代谢影响很大，胞内PH降低0.2个单位，就足以使磷酸果糖激酶失活，使细胞的生长受阻；而胞内 pH 升高 0.2 个单位 , 可以提高糖酵解速度 50%。3.1.2 溶氧阶段培养不同细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均不相同。 有人发现细胞生长的最适 溶氧值为 60% , 但有人发现杂交瘤的最适溶氧为100%。一般说来 , 溶氧主要影响细胞的繁殖, 而对产物的生成无直接影响 , 通过影

9、响细胞生长间接起作用。 通常在细胞生长初期控制 溶氧的较低的水平 , 在对数生长期 , 当细胞达到较高的浓度时 , 提高溶氧水平； 在产物生成 期 , 应控制溶氧的适当水平。溶氧过高 , 细胞就会加速消耗营养物质 , 产生许多代谢产物。 这些代谢产物对细胞有抑制作用 , 会大大降低细胞的存活率 , 降低产物的比生成速率。 溶氧 过低 , 细胞过氧的需求得不到满足 , 依然会降低产物蛋白的产率。3.1.3 化学试剂诱导阶段培养如果构建的细胞上有可诱导基因 , 进入产物生成期后 , 就可以添加化学试剂对基因 进行诱导 , 以实现目的基因的高表达 , 比如将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个 转

10、录单位置于同一载体 , 分别受金属硫 (MT) 和 SV40 早期启动子控制 , 具有用氨甲喋呤 (MTX) 使基因扩增和利用金属 Zn2+诱导的双重功能，有利于尿激酶的高表达。细胞在细胞周期的不同时期 , 不仅蛋白的分泌速率不同 , 而且所分泌蛋白的类型和糖 基化程度也可能不同。 因此， 研究并控制细胞的生理状态很重要。 然而 ， 在细胞培养中 ， 细 胞生理状态的检测很麻烦。有人发现 ， 细胞大小随各时期变化很明显 ， 因此可以作电子细胞 计数器就行了。 分段培养应结合具体的培养条件进行。 有些细胞的最适生长温度和产物生成 温度相同 ， 就不能进行温度阶段培养 ， 而应寻找别的差异条件。

11、在细胞生长期有的细胞可能 会因比生长速率过大而产生非生产性细胞 ， 这时就应控制比生长速率在一个适当的范围。3.2 代谢调控培养乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢产物， 对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。 尽管灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物。 但是 ， 一方面 由于灌注培养细胞浓度很高 ， 提高灌注速率 ， 营养成分的供给十分充分 ， 氨和乳酸的产生 速率也增加了。另一方面 ， 过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率 ， 降低产物的比产率 ， 加上细胞对营养的利用并不彻底 ， 培养液中会残留大量的蛋白 ， 造成提取纯化的不便和培 养基的浪费。所以 ， 在培养中调控动物

12、细胞的代谢途径一直较受重视。通过代谢调控， 可以减少副产物的产生 ， 降低细胞的死亡速率 ， 还可以控制灌注速率和培养液成分 ， 控制细胞 的状态和比生长速率 ， 以提高目标蛋白的产率。具体有以下方法。3.2.1 控制葡萄糖浓度法乳酸浓度升高 ， 会导致比生长速率降低 ， 比死亡速率升高。乳酸的降低可更换葡萄 糖为己糖如果糖或半乳糖 ， 还可限制葡萄糖减少乳酸的生成 ， 使初始葡萄糖浓度较低 ， 在 培养过程中再添加。 在控制葡萄糖浓度法培养中 ， 生长期可以使葡萄糖浓度稍高 ， 以促进细 胞生长 ; 在产物合成期降低葡萄糖的浓度 ， 降低乳酸的产生速率 ， 避免乳酸的积累 ， 减少 毒害 ，

13、 降低死亡速率 ， 维护持活细胞数在较高水平。 同时还可以降低比生长速率 ， 增加目标 蛋白的产生速率。灌注葡萄糖的同时 ， 要间歇或连续地加入其他组分 ， 以避免营养缺乏 ， 其中谷氨酰 胺要保持在较低水平 ， 因为细胞的生长不依赖糖酵解 ， 即使没有葡萄糖 ， 细胞仍可以通过 降解谷氨酰胺获得能量。 假如谷氨酰胺的浓度过高 ， 细胞就会偏向谷氨酰胺酵解 ， 从而削弱 这种方法的效果。由于葡萄糖的价格相对低廉 ， 这种方法很有前途。3.2.2 控制谷氨酰胺法上面提到 ， 没有葡萄糖 ， 细胞可以利用谷氨酰胺作能量物质。因此 ， 控制谷氨酰胺比 控制葡萄糖要容易些。 控制谷氨酰胺浓度的目的 ，

14、 主要是减少氨的产生。 氨对细胞的毒性比 乳酸大得多 ， 表现为降低比生长速率 ， 增加死亡速率。 控制谷氨酰胺法与控制葡萄糖法一样 ， 要维持葡萄糖在较低水平。3.2.3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法在细胞中 , 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。葡萄糖消耗上升 , 则谷氨酰胺消耗 下降 , 反之亦然。在相当大的一个范围内 , 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与其浓度成正比。 控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生 , 还能有效控制比生长速率。 在细胞生长期 提供充分的营养 , 供细胞的需要 ; 在产物合成期 , 降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度或流量 , 降低比生长速率 , 增加目标蛋白的产率。3.2.

15、4 代谢产物的去除通常使用透析膜 , 超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵离子。 灌注培养发展到 现在 , 还有许多急待解决的问题。其最大的缺点是培养基的利用不充分 , 造成一定的浪费。 随着细胞培养技术和产品分离技术的进一步发展 , 建立细胞培养与产物分离的耦合系统 , 能 充分利用培养液 , 降低生产成本 , 一直是人们追求的目标。4 动物细胞无血清培养技术动物细胞无血清培养是生物科学领域中的重要研究课题之一。 由于无血清培养基可以 是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基。 因而它不仅为研究和阐明细 胞生长、 增殖和分化的调节机制提供了有力的工具， 而且为现代生物技术， 尤其