微生物学教程周德庆第二

1、 第6章 微生物的生长及其控制 第1节 测定生长繁殖的方法 第2节 微生物的生长规律 第3节 影响微生物生长的主要因素 第4节 微生物培养法概论 第5节 有害微生物的控制 微生物不论在自然条件下还是在人为条件下 发生作用，都需要达到一定的数量才能实现。 微生物生长的定义是指微生物个体数目的增 加，即繁殖。 微生物死亡的定义是指细胞永久失去繁殖的能力。 第1节 测定生长繁殖的方法 一、测生长量 （一）直接法 1. 测细胞干重 2. 测细胞湿重 （二）间接法 1. 比浊法 2. 测生理指标 二、计个体数 （一）直接法 用计数板在光学显微镜下直接观察并计数。 荧光染料染色： 活菌为绿色，死菌为红色

2、（二）间接计数法 1. 比法浊 2. 平板菌落计数法 （1）浇注平板法（pour plate） （2）涂布平板法（spread plate） 3. 厌氧菌的菌落计数 滚管培养法（教材P168） 第2节 微生物的生长规律 一、微生物的个体生长和同步生长 研究单细胞微生物的个体生长很困难。 1、同步培养（synchronous culture）： 使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同 样的细胞生长和分裂周期的培养方法。 2、同步生长（ synchronous growth）： 某细胞群体中所有个体细胞处于分裂步调一致 的生长状态。 3. 获得同步生长的方法 （1）环境条件诱导法 （2）机械筛选

3、法 膜洗脱法 薄膜洗脱法收集的大肠杆菌在葡 萄糖基础培养基中的同步生长。 二、单细胞微生物的典型生长曲线（同步，封闭） 单细胞微生物的典型生长曲线 （一）延滞期（lag phase） 培养开始最初细胞数目没有增加的一段时期。 特点： 1. 生长速率常数为零，但合成代谢十分活跃。 2. 细胞形态变大或增长。 3. 细胞内RNA（尤其是rRNA）含量增高。 4. 对外界不良条件反应敏感。 生长速率常数（R）：单位时间内细胞数目或细胞量的变化。 影响延滞期长短的主要因素 （1）菌种 生长快的菌比生长缓慢的菌延滞期短。 （2）接种菌菌龄 采用对数生长期的菌作为接种菌可缩短延滞期。 （3）接种量 适当提

4、高接种量可缩短延滞期。 （4）培养基成分 营养丰富，与种子培养条件接近的培养基可缩 短延滞期。 （二）指数期（对数生长期）（exponential phase） 紧接延滞期后细胞数目以几何级数增长的一段时期。 特点： 1. 生长速率常数R最大，代时G最短。 2. 细胞进行平衡生长。 3. 酶系活跃，代谢旺盛。 代时（G）：1个细胞分裂为2个所需要的时间。 影响指数期微生物代时长短的主要因素： 1. 菌种 原核比真核短，小的真核比大的真核短。 1. 营养成分 2. 营养物浓度 生长限制因子（growth-limited facter） 4. 培养温度（教材表6-1） （三）稳定期（station

5、ary phase） 是在对数生长之后细胞群体进入的生长与死亡处于 动态平衡的一段时期。 特点： 1. 生长速率常数R=0 2. 菌体产量达到最高 3. 某些细胞开始启动一些特殊的代谢途径: 形成芽孢，形成贮存颗粒，形成次级代谢产物。 稳定期到来的原因： 1. 营养物质的耗尽。 2. 营养物比例失调。 3. 有害代谢产物的积累。 4. pH、氧化还原势等条件越来越不适宜。 （四）衰亡期（decline phase,death phase） 整个群体生长速率R为负值的时期。 特点： 1. 个体死亡速度超过新生速度，R为负值。 2. 细胞形态发生多形化。 3. 细胞开始自溶。 产生衰亡期的主要原因

6、： 环境对继续生长越来越不利。 三、微生物的连续培养 1. 连续培养的目的 长时间地保持微生物的对数生长状态以提高经 济效益。 2. 连续培养的方式 恒浊器 恒化器 单级 多级 单级 多级 3. 连续培养的利弊 利：高效节约，自控，产品质量稳定 弊：菌种易退化，易污染，营养物利用率低于单 批培养。 4. 连续培养时间是有限制的 四、微生物的高密度培养 自学教材P159-160 第3节 影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的因素很多，但主要的因素 有4个：水分、温度、氧气和pH值。 一、水分对微生物生长的影响 1. 水活度 水活度（water activity，aw）：它表示在天然或人 工环

7、境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的 含量。 aw = P P0 （教材P 93） 农业土壤中的aw一般在0.91之间。 生长最低 aw 细菌 一般：0.900.98 嗜盐菌：0.75（约5.5M NaCl） 酵母菌 一般：0.870.91 高渗酵母：0.610.65 鲁氏酵母：0.60 霉菌 一般：0.800.87 耐旱菌：0.650.75 双孢旱霉：0.60 2. 调剂溶质（compatible solutes） 生活在水活度低（渗透压高）的环境中的微生物 如何获得水分（细胞处于正态水平衡positive water balance）？ 靠提高细胞内部溶质的浓度： （1）泵入无机离子

8、（2）合成或提高某种有机溶质的浓度（直接合成 或从环境中积累）。 用来调节细胞内水活度或溶质浓度的溶质叫 调剂溶质（compatible solutes）。它必须不阻碍 细胞内其他生化过程。 细胞内调剂溶质的浓度取决于外部溶质浓度。 每种生物合成或积累调剂溶质的最大量是由每种 生物的基因决定的一种特性。这决定了不同的生 物对水活度的不同耐受性。 微生物的调剂溶质 微生物 积累的主要溶质 生长最低aw 细菌 甜菜碱，脯氨酸（G+） 0.97-0.90 淡水蓝藻 蔗糖，海藻糖 0.98 海水蓝藻 -葡萄糖基甘油 0.92 盐湖蓝藻 甜菜碱 0.90-0.75 嗜盐厌氧 甜菜碱，ectoine， 海

9、藻糖 0.90-0.75 光合细菌 极端嗜盐古菌 KCl 0.75 和一些细菌 微生物的调剂溶质 微生物 积累的主要溶质 生长最低aw 海洋藻类 甘露醇，各种糖苷， 0.92 脯氨酸，二甲基巯基丙酸 杜氏藻 甘油 0.75 (嗜盐绿藻) 耐干旱酵母 甘油 0.83-0.62 耐旱丝状真菌 甘油 0.72-0.61 杜氏藻 : Dunaliella 微生物中几种主要 的有机调剂溶质 甜菜碱 海藻糖蔗糖 甘油 甘露醇 二甲基巯基丙酸 二、温度对微生物生长的影响 1. 微生物生长的三个温度常数温度三基点 最低生长温度（minimum temperature） 最适生长温度（optimum tempe

10、rature） 最高生长温度（maximum temperature） 三基点对于每种微生物一般是其特有的，但又不 完全固定，它们能被其他的环境因子轻微地改变， 尤其是生长的培养基质对基本温度的影响大。 最低生长温度：在此温度下，生长不会发生。 细胞膜不能保持流动状态，影响营养物质的 运输和质子动力的形成。 最高生长温度：超过这一温度，不可能生长。 高温使一些分子失活，细胞膜破裂。 最适生长温度：生长最快。 2. 微生物生长的温度范围 根据微生物的最适温度可将它们划分为4大群： （1）嗜冷菌（psychrophiles） Topt15 永久寒冷的地区。 （2）嗜温菌（mesophiles） T

11、opt 45 温血动物，热带与温带土壤、水域。 （3）嗜热菌（thermophiles） 很热的环境中：堆肥。 Topt 45 （4）超嗜热菌（hyperthermophiles） Topt80 极端热的环境：火山口，硫磺热泉，自燃煤堆。 Growth rate 3. 嗜冷菌冷适应的分子机理 酶在冷的条件下能发挥最佳功能。 膜中含有较高浓度的不饱和脂肪酸 4. 嗜热菌热适应的分子机理 酶和其他蛋白质对热的稳定性更高，在高温有最 好的功能（增加盐桥、大量的疏水内核）。 细胞内特殊的溶质（环2,3-二磷酸甘油）。 细胞内存在大量的分子伴侣。 膜中含饱和脂肪酸、植烷和醚形成的单层膜。 三、氧气对微生

12、物生长的影响 1. 按照微生物与氧的关系，可将它们分为2大类： 好氧微生物（aerobes） 厌氧微生物（anaerobes） 2大类又可进一步分为5类： 专性好氧（obligate or strict aerobes） 兼性厌氧（facultative anaerobes） 微好氧（microaerophilic bacteria） 耐氧菌（aerotolerant anaerobes） 专性厌氧菌（obligate anaerobes） 好氧 厌氧 5类细菌在 含有巯 基乙醇的培养基中的生 长和分布。 2. 氧的毒性形式的产生和消除 羟自由基（OH） 超氧化物（O2- ） 单一态氧（ O2

13、） 过氧化氢（H2O2） 在呼吸过程中O2还原成H2O中产生的不可逆 副产物 氧的毒性形式： （1）过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2） O2氧化黄素蛋白无一例外地要产生一种有毒的 化合物H2O2 O2+e- +H+ H2O2 FP H2O2+H2O2 2H2O+O2 Catalase H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+ Peroxidase 过氧化氢酶 过氧化物酶 （2）超氧化物（superoxide， O2- ） 由H2O2的氧化作用以及其他酶（黄素蛋白，Q，铁硫蛋白）催化的氧化作用或 加氧作用产生。 2 O2- +2H+ O2+H2O2 超氧化物岐化酶（SO

14、D） 2 H2O2 2H2O+O2 过氧化氢酶（catalase） O2+ e- O2- FP，FeS, Q 等 （3）羟自由基（hydroyl radical， OH ） 由离子辐射产生，少量的羟自由基可由于细胞 内H2O2的积累而产生： H2O2+e-+H+ H2O+OH （4）单一态氧（singlet oxygen，O2） 能量很高，外围电子高度活化。 产生方式： 光化学反应（细胞含光敏色素P）： P+hv P* P*+O2 O2 生物化学反应：各种过氧化物酶。 类胡萝卜素能淬灭单一态氧。 小结： 毒性氧形式的产生 O2+e- O2- O2- + e- +2H+ H2O2 H2O2+ e

15、- + H+ OH OH+ e- + H+ H2O O2+光+光敏色素 过氧化物酶 O2 有毒氧的消除： 超过氧化物岐化酶酶 superoxide dismutase 2 O2- +2H+ O2+H2O2 过氧化氢酶 catalase H2O2+H2O2 2H2O+O2 过氧化物酶 peroxidase H2O2+NADH+H+ 2H2O+NAD+ 类胡萝卜素 淬灭单一态氧 四、pH值对微生物生长的影响 每一种生物都有一生长的pH值范围，一般有相 当固定的最佳pH值。 绝大多数自然环境的pH 值在59之间。 只有少数生物能在低于2或高于10的pH中生长。 真菌 最适pH5 细菌 最适pH一般为

16、中性 6.07.5 放线菌 最适pH 7.08.0 1. 专性嗜酸菌（obligate acidophilic bacteria） 在pH 2.04.0 生长，但不能在中性条件下生长。 专性嗜酸菌的细胞膜在中性pH时溶解，细胞裂解 死亡。 专性嗜酸菌包括：硫杆菌属（Thiobacillus），硫 化叶菌（Sulfolobus），嗜热支原体（Thermoplasm） 等。 2. 嗜碱微生物（alkaliphilic microorganisms） 生长最适pH 1011 ，在中性条件下不生长。 嗜碱微生物包括： 细菌：芽孢杆菌，外硫红螺菌（Ectothiorhodospira） 放线菌：链霉菌，

17、棒状杆菌 蓝细菌 古细菌 真菌 参阅土壤与环境微生物学第20章 必须记住： 这里讲的pH值是指外部pH值，细胞内的pH值一般都是保持中性左右的。 在极端嗜酸或极端嗜碱菌中，细胞内的pH值可能比中性偏移11.5 pH单位。 大多数微生物的最适pH是在68之间，它们叫嗜中性微生物，细胞质pH保持 中性或与中性非常接近。 3. 缓冲剂（Buffers） 培养基中常需要加缓冲剂来维持pH的相对稳定。 缓冲剂的有效pH范围很窄。不同的pH范围需要不同 的缓冲剂。 磷酸盐（常用KH2PO4）是接近中性的pH （6-7.5）范 围的极好的缓冲剂 第4节 微生物培养法概论 一、实验室培养法 （一）固体培养法

18、1、好氧菌的固体培养 琼脂平板，试管斜面，克氏扁瓶。 2、厌氧菌的固体培养 （1）高层琼脂柱 （4）厌氧罐 （2）厌氧培养皿 （5）厌氧手套箱 （3）亨盖特滚管技术 厌氧菌的分离：稀释摇管法 （二）液体培养法 1、好氧菌的液体培养 在液体培养中，氧的供应始终是好氧菌生长繁殖的限制因子。提高氧浓度的措 施有： （1）浅层液体静止培养 （2）摇瓶培养 （3）深层液体底部通气 （4）对培养液进行机械搅拌 2、好氧菌液体培养法 （1）试管液体培养 （2）三角瓶浅层液体培养 （3）摇瓶培养 （4）台式发酵罐 3、厌氧菌的液体培养法 （1）在培养液中加入 还原剂：巯基乙醇，半胱氨酸，VC，疱肉。 （2）将

19、培养物放入厌氧罐或厌氧手套箱中。 （3）在液面封上石蜡油，凡士林-石蜡油。 二、生产实践中培养微生物的装置 （一）固态培养法 1、好氧菌的曲法培养 2、厌氧菌的堆积培养 （二）液体培养法 1、浅盘培养 2、深层液体通气培养 发酵罐 第5节 有害微生物的控制 一、几个基本概念 控制害菌 的措施 杀灭 抑制 灭菌彻底杀灭（一切微生物） 消毒部分杀灭（仅杀灭病原菌） 防腐抑制霉腐微生物 化疗抑制宿主体内的病原菌 sterilization disinfection antisepsis chemotherapy 二、物理灭菌因素的代表高温 高温，辐射，超声波，微波，激光，静高压。 过滤。 （一）高温

20、灭菌的种类 高温灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 灼烧 烘箱内热空气灭菌法 常压 加压：常规加压灭菌，连续加压灭菌 巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法 1、干热灭菌（dry heat steriliazayion） 灼烧 （烧红） 接种环、针 烘箱（150-170，1-2h） 干燥培养皿、移 液管等玻璃器皿 2、湿热灭菌（moist heat sterilization） 用100 以上的加压蒸汽进行灭菌。 （1）常规加压蒸气灭菌法（normal autoclaving） 121 （1kg/cm2） 15-20min 115 （0.7kg/cm2） 30-35min （2）连续加压蒸气灭菌（conti

21、nuous autoclaving） 仅用于大型发酵厂的大批培养基灭菌。 让培养基在管道的流动过程中快速升温（135 140 ）、维持（515s）和冷却，然后流 进发酵罐。 （3）间歇灭菌（fractional sterilization, tyndallization） 适用于不耐热的培养基的灭菌。 80100 ，1560min。 37 保温过夜。 重复3天 （4）巴氏消毒法（pasteurization） 专用于液态风味食品或调料。 6063 30 min LTH 72 15 s HTST （5）煮沸消毒法 100 数分钟。 热死时间（thermal death time） 热死温度（th

22、ermal death point） （二）影响加压蒸气灭菌效果的因素 1、灭菌物体含菌量 含菌量越高，需要的灭菌时间越长。 2、灭菌锅内空气排除程度 3、灭菌对象的pH值 pH6.0 时，微生物易死 pH 60.-8.0 时，不易死亡 4、灭菌对象的体积 （三）高温对培养基成分的有害影响及其防止 1、有害影响 形成沉淀 破坏营养 改变pH 2、防止方法 分别灭菌 低压间歇灭菌 过滤除菌 其他方法 三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂 化学因素 表面消毒剂 化学治疗剂 液体 气体 抗代谢药物：黄胺 抗生素 生物药物素 （一）表面消毒剂 （二）化学治疗剂 化学治疗（chemotherapy）：是应用对

23、寄生生物有 专门作用的化学合成药物，这种药物能够杀死寄生 物或抑制寄生物在机体内增殖，而对宿主没有或很 小毒性。 化学治疗剂（chemotherapeutant）：用于化学治 疗的化学物质。包括化学合成的药物，抗生素等。 自学教材178-182页 化学治疗剂对微生物的作用范围 氮二烯五环，吡咯 多烯（烃） 亚胺环己酮，放线菌酮 抗生素（antibiotics） 1、定义 抗生素是一类由微生物或其他生物生命活动过 程中合成的次级代谢产物或其人工衍生物，它们在 很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动。 2、产抗生素的生物种类 大多数抗生素是三种主要的微生物：细菌、放线菌和丝状真菌的次级代谢 产

24、物。 只有少数抗生素是较高级的真菌、藻类和植物所产生，而且这些抗生素都 普遍具有较低的抗菌活性和较低的专一性。 放线菌产生了数量最多、品种最多的抗生素。 细菌产生的抗生素大多为多肽类。 粘细菌研究较少，但已经显示出产生抗生素的频率很高。 抗生素多学科研究入门美Giancarlo Lancini编，王以光译， 人民卫生出版社，1998 3、抗生素的作用部位（靶位） （1）细胞壁（2）细胞膜（3）特殊代谢过程 （4）核糖体（5）DNA（6）RNA的合成 4、抗细菌的抗生素 （1）青霉素主要抗G+ 青霉素G：对G+菌有强效，对G-菌效果差一点， 对酸敏感， 对青霉素酶敏感。 6-APA 青霉素V：比

25、青霉素G 对酸稳定 氨苄青霉素：对酸稳定，抗G+和G-。 羧苄青霉素：抗G-，对酸稳定，吸收差。 甲氧西林：抗青霉素酶，效果不如 青霉素G，对酸不稳定。 Ticarcillin：类似羧苄青霉素，但 对假单胞菌更有效。 红霉素 erythromicin （2）红霉素主要抗G+ 是最常用的大环内脂类抗生素，由红霉素链霉菌（Streptomycin erythraeus） 产 生。 与核糖体50S亚基作用， 抑制蛋白质的合成。 对军团菌尤其有效。 （3）链霉素抗G菌为主，也抗结核分枝杆菌。 链霉素，卡那霉素（kanamycin），庆大霉素 （gentamycin），新霉素（neomycin）等都是氨

26、 基苷类抗生素。过去临床上常用来抗G-细菌，现在 一般作为保留药物，只有当其他抗生素无效时才起 用。 链霉素与细菌30S亚基反应，抑制细菌蛋白质的 合成。 链霉素 streptomycin 链 霉 胍链 霉 糖 与30S亚基反应， 抑制蛋白质的合 成。 庆大霉素 Gentamicin 庆大霉素 由紫红小单胞菌 Micromonospora purpurea 产生。抗G+和G-。 （4）万古霉素抗G+和G-。 万古霉素（vancomycin） 由东方链霉菌Streptomycin orientalis 产生。 阻断新生肽聚糖单位的聚合，抑制细菌细胞壁 的合成。 （5）头孢霉素抗G+和G-。 头孢

27、霉素（Cephalosporins） 从真菌顶头孢霉（Cephalosporium acremonium） 中发现。抗菌谱广，一般需注射。 7-氨基头孢霉素烷酸 第一代头孢对G+菌疗效好。 第二代头孢对G+菌疗效好，对很多G-菌疗效也好。 第三代头孢对许多G-菌（如铜绿假单胞菌）具有抗性且不被内酰胺酶所破坏，常能 达到中枢神经系统。 （6）广谱抗生素氯霉素，四环素，金霉素，土霉素 氯霉素 Chloramphenicol 氯霉素（Chloramphenicol）： 最早由委内瑞拉链霉菌Streptomycin venezuelae生产， 现由化学合成。毒性大，只在不得已时应用。 四环素（Tetr

28、acycline）： 由链霉菌产生，或由半合成而来。主要是抑菌。高 剂量会产生恶心、腹泻、小儿黄牙，并对肝肾造成 损害。 5、抗真菌的抗生素 （1）与麦角甾醇结合多烯烃（polyene）类抗生素 两性霉素B（Amphotericin B） 制霉菌素（Nystatin） 作用机制：与细胞膜上麦角甾醇结合，破坏 细胞膜的结构，影响细胞膜的透性，使细胞裂解。 疗效与副作用相当。仅用于危及生命的感染。 都由链霉菌产生 （2）抑制麦角甾醇合成吡咯类（azole）抗生素 和丙烯胺（allylamines） 咪唑（imidazole） 酮康唑（Ketoconazole） 作用机制：抑制麦角甾醇的合成，使细胞

29、裂解。 几乎没有严重的副作用，具有广谱的抗真菌效果。 一般用于表面感染。 咪康唑 酮康唑 （3）其他抗真菌药物 灰黄霉素（Griseofulvin）： 由青霉菌产生。抑制细胞分裂，抑制蛋白质 和核酸的合成。口服，治疗慢性皮肤真菌感染。 5-氟胞嘧啶： 化学合成。 使RNA失去功能。 是一种有效的抗真菌药物。用于治疗绝大多数系统真菌感染。 副作用：红疹，腹泻，恶心，贫血，肝损伤。 Polyoxins（多氧菌素）： 抑制几丁质的合成从而 抑制真菌细胞壁的合成。 在临床上尚未使用。 长春花碱（ vinblastine ） 长春花新碱（ vincristine ） 6、抗生素的活力单位 抗生素的活力单

30、位称为抗生素的效价（titre）。 抗生素效价一般用“单位”表示。 各种抗生素的 1mg 游离碱=1000单位 最低抑制浓度 （minimum inhibitory concentration）： 在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓 度。是评定某化学药物药效强弱的指标。 最低抑菌浓度(MIC)的测定 抑菌圈 7、半合成抗生素 对天然抗生素的结构进行人为的改造后的抗 生素叫做半合成抗生素。 8、微生物的抗药性 （1）阻止药物进入 改变细胞膜的透性； 改变药物的透性 （2）将进入细胞内的药物破坏或排出细胞 （3）改变药物作用的靶子 （4）形成“救护途径” 小结 第6章 微生物的生长及其控制