肿瘤动物模型构建实验技术

1、肿瘤动物模型得建立可以：1)评价抗肿瘤免疫治疗得疗效；作为抗肿瘤药物筛选模型；为肿瘤转移研究提供更好得研究平台；为研发抗肿瘤转移性药物提供良好得实验工具。实验方法：诱发性肿瘤动物模型放射线、 致癌病毒诱发动实验方法原理： 诱发性肿瘤动物模型就是指研究者用化学致癌剂、 物得肿瘤等。实验材料：肿瘤细胞小鼠 试剂、试剂盒、无血清培养基质、 3%中性甲醇石腊仪器、耗材、低温离心机、血球计数器、游标卡尺 实验步骤、肝癌1二乙基亚硝胺(DEN)诱发大白鼠肝癌1 )取体重 250 g 左右得封闭群大白鼠，雌雄不拘；(2)按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用0、25%DEN水溶液灌胃，剂量为10

2、mg/kg，每周一次，其余 5天用0、025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用；3)共约 4 个月可诱发成肝癌；4)也可以单用 0、005%掺入饮水中口吸服 8 个月诱发肝癌。2 4-2甲基氨基氮苯(DBA)诱发大鼠肝癌(1)用含0、06%DBA得饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1、52 mg/kg ;(2) 46月就有大量得肝癌诱发成功。3 2-乙酰氨基酸(2AAF)诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌(1)给成年大鼠含 0、03% 2AAF标准饲料;(2)每日每平均 23 mg 2AAF (也可将2AAF混于油中灌喂)，34月后有8090%动物产生肝肿瘤。4二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：(1

3、)用剂量为每日0、314 mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予;(2)69个月后255/300大鼠发生了肝癌。5 .亚胺基偶氮甲苯(OAAT诱发小鼠肝癌(1 )用1%OAAF苯溶液(约0、1 ml含1 mg)涂在动物得两肩胛间皮肤上，隔日一次，每 次 2 3 滴,一般涂 100 次。2)实验后 7 8 周即而出现第一个肝肿瘤,7 个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。(3)或用2、5 mg OAAT溶于葵瓜子油中，给 C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也 可诱发成肝癌。6黄曲霉素诱发大鼠肝癌(1)每日饲料中含 0、0010、015 ppm,混入饲料中喂 6个月后,肝癌诱发率达 80。二、胃癌

4、1 甲基胆蒽诱发小鼠胃癌1)取 20 g 左右得小鼠,无菌手术下,在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽(MC)线结。( 2)含 MC 得线结就是用普通细线,在一端打结后,将线结置于盛有 在酒精灯上微微加温,使 MC 液化渗入线结。 MC 浓度为 0、 050、MC 小玻璃试管内,1 g 20-甲基胆蒽内浸入1020根线。3)手术埋线后 48个月可诱发成功胃癌。2不对称亚硝胺诱发小鼠胃癌剂量为 0、 25 ml/kg 体重, 3 个月后全部动物发生前胃乳头状癌,78个月后有 85100%发生前胃癌。昆明种最敏感。A系次之，615系小鼠敏感性最差。3甲基亚硝基醋酸尿素诱发小鼠胃癌给BD大鼠饮水中加甲基亚硝基

5、醋酸尿素，剂量为2 mg/kg体重，每周饮用5次，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。三、食管癌1 .甲基苄基亚硝胺(MBNA )诱发大鼠食管癌1 )取体重 100 g 以上得 Wistar 大鼠;0、751、2）任其食用含甲基苄基亚硝胺得饮水， 并将 MBNA 掺入饲料中使每日摄入量达5 mg/kg 体重；3）80100 天可诱发成食管癌。2二烃黄樟素（ Dihydrosafrole ）诱发大鼠食管癌1 ）二烃黄樟素就是一种制备啤酒得调味品，在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万250010000 ppm ）黄樟素，就能引起 2075%得食管癌。3甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌（ 1 ）用 0、

6、 2%或 0、 005%得甲基苄基亚硝胺水溶液，给动物经口灌喂，每天一次，大鼠灌 注剂量为 1 mg/kg 体重；（2）至第 27天即发现一例食管乳头状瘤，154 天发现第一例食管癌， 11 个月食管癌得发生率为 53%。四、肺癌1 二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌（1）小白鼠每周皮下注射 1%DEN水溶液一次，每次剂量56 mg/kg , DEN总剂量达到868 mg ;2）观察时间为 100 天左右时，发癌率可达 40%。（3）DEN总剂量达到1176 mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。2 乌拉坦诱发肺腺癌（1）小鼠（A系，111/2月龄）较大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%乌

7、拉坦生理盐水液 0、1 0 、 3 ml ，间隔 3 5 日再注，共注 23 个月，每只小鼠用量约为 100 mg；2）注后 3 个月肺腺癌发生率为100% ，而且多数为多发性，这种诱发瘤为良性。3 苯并芘诱发肺腺癌（ 1 ）猴气管内注入 3 ， 4-苯并芘 共 10 次；（苯并花为315 mg与等量之Fe2O3混合液），每周一次,2） 6 只猴中有 2 只诱发肺得鳞状上皮癌。4 硫酸铵气溶胶诱发肺腺癌1 ）用硫酸胺气溶剂给 100 只大鼠吸入；2） 13 个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。5甲基胆蒽诱发肺腺癌(1)用 0、 2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入，每次 胆蒽5 mg

8、)每周一次，共6次；0、1 ml (含甲基2) 53 周后有 62、 5%动物发生了肺癌。五、鼻咽癌1 二甲基胆蒽(MC)诱发大鼠鼻咽癌(1)取直径23 mm得硬质塑米管，在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约 填以结晶体 MC。3、5 cm,管内2)小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC 能从小妃溢出。(3)取体重120 g左右得大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，由前鼻孔将上述含MC得塑料小管插入鼻腔,利用前鼻孔较小管粗端为小得特点,稍加用力,迫使小管全部进入鼻腔内, 其尖部可达鼻咽腔。不需另加固定,即可使小管长期留于鼻腔内。( 4)待到预定时间(半年以上),或动物自行死亡时,到其鼻咽

9、部, 脱钙后,石蜡包埋,进行连续切片。发癌率可达 60%以上。10%福尔马林固定,2 二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌( 1 )取 120 g 左右大白鼠,雌雄均可,乙醚麻醉后,用磨平针尖得 轻插入,针尖可达鼻咽腔；8 号针头,从前鼻孔轻(2)经注射器灌注用 1%吐温-80新配得33、3%DEN混悬液0、0 2 ml(含DEN 6 7 mg)每周1 次,共 15 20 次,可诱发成鼻咽癌。六、宫颈癌1 二甲基胆蒽(MC)诱发宫颈取雌性小白鼠,及磨纯得弯针, 定于背部肌肉,以附有 0、 1mgMC 得棉纱线结在动物不麻醉得状态下,借助于阴道扩张器 将线穿入宫颈。 经右宫角背部穿出,使线结固定于宫颈口

10、。 线得另一端则固 缝合皮肤,挂线以后,同日开始连续注射青霉素2 3 天。以防术后感染。至一定时间(半年左右)处死动物,宫颈组织用10% 福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片。七、结肠癌1.二甲基苄肼(Dimethlhydrazine，DMH)诱发鼻咽癌(1 )给四周龄得雄性大白鼠，皮下注射二甲基苄肼(Dimethlhydrazine , DMH)每周一次,连续 21 周，每次 DMH21mg/kg ；（2 ）最后一次给药后14周，处死动物;（3）降结肠部位用 Bouin 液固定，脱水，石蜡包埋，切片。所用之 含400 mg得母液，并加 EDTA37 mg用氢氧化纳（0、DMH 先配成每 100

11、ml1 N）液将pH调至6、5备用。注意事项1 要设计不同得实验组与对照组，每组动物数一般为5-10 只;2一般接种肿瘤 6-8 周后，小鼠得肿瘤可生长至直径为 可眼球取血，分离血清并保存血清，织切片（或-80 C保存）,作相应得免疫组织化学染色， 石腊包埋，作常规 HE 染色。15-20mm （即小鼠会濒临死亡 ）时，处死小鼠，取肿瘤组织照相， 取部分肿瘤组织作冰冻组取部分肿瘤组织用 3%中性得甲醛固定，其她1 芳香胺及偶氮染料类致癌物得特点1)通常需要长期、大量给药才能致癌;肿瘤多发生于远隔作用部位得器官如膀胱、肝等;有明显得种属差异;其本身不就是直接致癌物，致癌就是由于其某种代谢产物得作

12、用;（ 5）其致癌作用往往受营养或激素得影响，例如，奶黄仅在以缺少蛋白质与核黄素得饲料 喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠得肝癌。2亚硝胺类得致癌特点1 ）致癌性强，小剂量一次给药即可致癌;（2）对多种动物（包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤得动物）得许多器官（包括食管、脑、鼻 窦等不易引起癌得器官）能致癌，甚至可以通过胎盘致癌，如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺 （ Diethy lnitrosamine,DEN ）可比较快地引起仔鼠得神经胶质细胞瘤;（ 3）具有不同结构得亚硝胺有明显得器官亲与性，例如二甲基亚硝胺等对称得衍生物常引 起肝癌， 不对称得亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌; 在大鼠， 二丁基亚硝胺能引起膀 胱癌，二戊基亚硝胺能诱发肺癌，而N-甲基-N-硝基-N-1-亚硝基胍则能引起胃肠癌。3黄曲霉毒素得致癌特点（1）黄曲霉毒素得毒性很强，很小剂量（ 1mg/kg 体重）即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭 致死;（2）其致癌性也极强，最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍，就是已知化学致癌物中作用 最