临床检验技士-临床免疫学和免疫检验讲义08

1、第八章荧光免疫技术第一节概述荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种0一、荧光的基本知识1荧光：某些物质受到一泄波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2. 发射光谱：固定激发光波长,在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。激发态电子凰 到的能级不同，发出的荧光波长就不同。3激发光谱：固主检测发射光荧光波长,用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应的荧光发射强 度谱图。4. 荧光效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。在一定范围内，荧光强度与激 发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。5. 荧光寿命：荧光物质被激发

2、后产生的荧光衰减到一泄程度时所用的时间称为荧光寿命。6. 荧光淬火：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、髙温、苯胺、酚、厂、硝基苯等）作用下，发 射荧光减弱甚至消退，称为荧光淬火，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能呈无法以 荧光的形式发射。7. 荧光偏振。二、荧光物质（-）荧光色素1. 异硫氤酸荧光素（FITC）：呈现明亮的黄绿色荧光。2.2. 四甲基异硫鼠酸罗丹明（TRITC）:呈橙红色荧光。3. 藻红蛋白（R-RE）：呈明亮的橙色荧光。（二）其他荧光物质1镌系螯合物：其中以ElT应用最广。Eu螯合物的激发光波长范弗|宽，发射光波长范伟1窄，荧光衰变 时间长，最适合用于时间

3、分辨荧光免疫测定。2. 酶作用后产生荧光的物质：4-甲基伞酮-B-D半乳糖昔本身无荧光，受半乳糖昔酶的作用分解成 4-甲基伞酮，后者可发岀荧光。英他如碱性磷酸酶的底物是4-甲基伞酮磷酸盐，辣根过氧化物酶的底物是 对疑基苯乙酸等。第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体要求将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgG后再作标记。（二）荧光素要求异硫氤酸荧光素最常用要求： 应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团,与蛋白质结合后不易解离,而未结合的色素及其降 解产物易于淸除： 荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率； 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；

4、与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质： 标记方法简单、安全无毒： 与蛋白质的结合物稳泄，易于保存。（三）抗体的荧光素标记1搅拌法：适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光素用量少。但 易引起较强的非特异性荧光染色。2. 透析法：适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。（四）荧光素标记抗体的纯化抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素。纯化方法可采用透析法或层析分离法。（五）荧光抗体的鉴定1. 荧光素与蛋白质的结合比率荧光素与蛋白的过量结合是非特异荧光着色的来源之一,而未结合者 有抑制特异性荧

5、光抗体反应的作用。荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率（F/P） 比值越大，则抗体结合的 荧光素越多，反之则结合越少。一般用于组织切片的荧光抗体，其F/P=1.5为宜，用于活细胞染色F/P=2. 4为宜。2. 抗体效价 可以采用双向免疫扩散试验测定,抗原含量为lg/L时，抗体效价1:16者较为理想。3. 抗体特异性吸收试验:向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后,再用于阳性标本染色，应不出现 明显荧光：抑制试验:阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色,荧光强度应受 到明显抑制。（六）荧光抗体的保存防止抗体失活和防止荧光淬灭。 小量分装，-20C冻存可保存23

6、年。真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存，在4C可保存13天。二、标本的制作组织材料可制备成右蜡切片（较少用）或冷冻切片。切片要求尽量薄些，以利于抗原抗体接触和镜检。 组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切而，使玻片粘上12层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。过程中应保持抗原的完整性，并在操作中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。三、荧光抗体染色与结果判断荧光抗体与抗原反应，一般在25379, 30分钟,不耐热抗原的检测则以4C过夜为宜。（一）直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素 少：缺点是敏感

7、度偏低，需制备特异性的荧光抗体。（二）间接法：可用于检测抗原和抗体，普通一抗+荧光二抗。灵敏度髙，仅需一种荧光抗体。（三）双标记法：FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本做荧光染色。（四）荧光抗体染色结果判断:在每次实验时均需设立实验对照（阳性和阴性对照）。阳性细胞的显 色分布有胞质型、胞核型和膜遍型三种类型。临床上根据特异性荧光强度达“ + ” （为荧光较弱但淸楚 可见）以上判左为阳性。四、荧光显微镜的基本结构（了解）光源通常用高压汞灯、瓦灯或卤素灯作为激发光源。（二）滤光片滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。观察FITC标记物可选用激发滤光片BG12,配以吸收滤光片0G

8、4或GG9.（三）光路分为透射光和落射光两种形式。（四）聚光器 聚光器有明视野、暗视野和相差荧光聚光器等。（五）镜头目镜有氟处理、消色差和复消色差三类镜头，常用的是消色差镜头。第三节荧光免疫分析的类型用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测莖_、时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）用镉系元素标记抗原或抗体，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨。（-）基本原理1时间分辨正常组织在激发光照射下可以发出一左波长的荧光，但该荧光寿命较短（110ns）,而镉系元素螯合 物的荧光寿命较长（101000 us） o故待短寿命背景荧光完全衰

9、变后再测定鉤系元素离子螯合物的特异性 荧光信号。2. Stokes位移：激发光谱和发射光谱的波长差,如果Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠， 相互干扰，影响检测结果的准确性。钱系元素任砾。3. 发射光谱和激发光谱：辆系元素发射光谱带较窄，多在613nm10nm。利用滤光片只允许此波段的荧 光通过，避免干扰。4. 荧光标记物的相对比活性：比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。5. 信号增强Eu标记抗原抗体复合物在弱碱性溶液中被激发后的荧光信号较弱，加入一种酸性增强液可使Eu从复 合物上完全解离下来，并与另一种螯合剂所螯合，以增强荧光信号。（二）标记物和标记方法1标记物：

10、多用Eu和Tb为标记物，其中Eu”最为常用。2.标记方法：澜系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂,英一端与 闕系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合。（三）方法类型1. 双抗夹心法:待检抗原与固相抗体结合，再与Eli标记抗体结合，在酸性环境下，复合物上的Ef解 离下来，在340nm激发光照射下,形成荧光。2. 固相抗体竞争法:待检抗原和Eu标记的抗原与固相抗体竞争结合,荧光强度与待检抗原成反比。3. 固相抗原竞争法:待检抗原和固相抗原竞争Eu*标记抗体,荧光强度与待检抗原含戢成反比（四）方法评价1. 优点：灵敏度髙：分析范围宽；标记结合物稳左，有效使

11、用期长；测量快速，易自动化；无放射性污染。2. 缺点：易受环境、试剂和容器中的翎系元素离子的污染，使本底增高。二、荧光偏振免疫测定利用抗原抗体竞争反应原理,根拯荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定 体液中小分子物质的含量。（一）基本原理荧光偏振免疫测左常用异硫包酸荧光素（FITC）标记小分子抗原。（二）方法评价荧光偏振免疫测左样品用量少；荧光素标记结合物稳泄，使用寿命长；方法重复性好：快速，易自动 化：试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质,不适宜测怎大分子物质；灵敏度较非均相荧光免 疫测定法低。三、荧光酶免疫测定利用酶标抗体（抗原）与待检抗原（抗体）反应，借助酶反

12、应荧光底物，经酶促反应生成稳泄且高效答案解析最早被用作标记免疫技术中标记物的是荧光素。关于荧光抗体技术错误的是A. 以荧光物质标记抗体进行抗原圧位B. 只能检测针对抗体的特异性抗原C. 即可检测抗原又可检测抗体D. 间接法中荧光抗体是抗抗体E. 一种荧光抗体可对多种抗原进行检测正确答案B答案解析荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在 荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行立性和左位 检测，或对自身抗体进行左性和滴度测左，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。荧光酶免疫测左：可 用于多种抗原抗体的检测。一般用于固圧标本的荧光

13、抗体的荧光素与蛋白质结合比率（F/P）值应为A. 0.5B. 1.0C. 1.5D. 2.0E. 2.4正确答案C答案解析一般用于组织切片的荧光抗体，其F/P=1.5为宜，用于活细胞染色以F/P=2. 4为宜。用于活细胞染色的荧光抗体的荧光素与蛋白质结合比率（F/P）值应为A. 0.5B. 1.0C. 1.5D. 2.0E. 2.4正确答案E答案解析用于活细胞染色以F /P=2. 4为宜。在荧光素标记抗体技术中，荧光素与抗体之间的结合靠的是A. 范徳华力B. 氢键C. 离子键D. 共价键E. 静电引力正确答案D答案解析在荧光素标记抗体技术中，荧光素与抗体之间的结合靠的是共价键。荧光抗体技术中，

14、临床上常用的只需一种标记抗体即可检测多种抗原的方法是A. 直接法B. 间接法C. 补体结合法D. 双标记法E. 荧光偏振免疫法正确答案B答案解析间接法可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异 抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度髙，而且在不同抗原的检测中只 需应用一种荧光抗体。用间接法免疫荧光技术检测组织中的抗原，应将荧光素标记A. 抗原B. 相应抗体C. 抗免疫球蛋白抗体D. 抗原-抗体复合物E. 抗C3抗体正确答案C答案解析用间接法免疫荧光技术检测组织中的抗原，应将荧光素标记抗免疫球蛋白抗体。目前临床上细菌菌种鉴定应用较多的方法是A.

15、ELISAB. 放射免疫技术C. 化学发光法D. 荧光抗体技术E. 金免疫技术正确答案D答案解析目前临床上细菌菌种鉴左应用较多的方法是荧光抗体技术。目前流式细胞技术中用于细胞染色应用了A. ELISAB. 放射免疫技术C. 化学发光法D. 荧光抗体技术E. 金免疫技术正确答案D答案解析荧光抗体技术的应用：自身抗体检测:痢原体检测；免疫病理检测;细胞表而 抗原和受体检测;流式细胞分析。下列有关制作荧光抗体染色标本的叙述中，不正确的是A. 材料要新鲜并立即处理或及时冷藏B. 切片标本一般不宜固定C. 若为组织材料，一般不宜采用石蜡切片法D. 脱落细胞可采用直接涂片法E. 标本切片要求尽量薄正确答案B答案解析制作荧光抗体染色标本，切片标本应固定。下列关于直接法荧光抗体试验的叙述中，不正确的是A. 简便易行，特异性好B. 敏感性较间接法差C. 可对抗原或抗体进行检测D. 检