第3章植物组织培养操作流程

1、 第三讲第三讲 一一 实验目的实验目的 植物细胞和组织培养的技术性强，要植物细胞和组织培养的技术性强，要 求无菌操作，通过本实验可使同学初求无菌操作，通过本实验可使同学初 步掌握常规的组织培养技术，加深对步掌握常规的组织培养技术，加深对 无菌操作的了解。无菌操作的了解。 二二 实验原理实验原理 1.1.植物的全能性：植物的全能性：植物体的任何一个植物体的任何一个 细胞都具有生长分化成为一个完整植细胞都具有生长分化成为一个完整植 株的能力，称为植物的全能性。植物株的能力，称为植物的全能性。植物 组织培养就是利用植物的全能性进行组织培养就是利用植物的全能性进行 离体无菌植物培养的一门技术。离体无菌

2、植物培养的一门技术。 2 2、植物组织培养的发展、植物组织培养的发展 v19041904年，德国植物胚胎学家年，德国植物胚胎学家HaningHaning用用 萝卜和辣根的胚进行培养，首次获得萝卜和辣根的胚进行培养，首次获得 组培的成功。组培的成功。 v19221922年，豌豆、玉米和棉花的茎尖培年，豌豆、玉米和棉花的茎尖培 育获得成功育获得成功 v19331933年，我国李继侗等进行银杏离体年，我国李继侗等进行银杏离体 胚培养获得成功。胚培养获得成功。 3 3、植物组织培养的应用、植物组织培养的应用 在作物育种上的应用（单倍体植株、种在作物育种上的应用（单倍体植株、种 间杂交、细胞融合、细胞突

3、变、种质保间杂交、细胞融合、细胞突变、种质保 存和基因工程）。存和基因工程）。 在作物脱毒和快速繁殖上的应用。在作物脱毒和快速繁殖上的应用。 在遗传、生理生化和病理研究上的应用。在遗传、生理生化和病理研究上的应用。 4 4、植物组织培养的内容、植物组织培养的内容 植物组织培养包括以植物和它的离植物组织培养包括以植物和它的离 体器官、组织、细胞和原生质体为外植体器官、组织、细胞和原生质体为外植 体的离体无菌培养，拥有几种不同水平体的离体无菌培养，拥有几种不同水平 的培养技术，即整体的、器官的、组织的培养技术，即整体的、器官的、组织 的、细胞和原生质的培养技术。的、细胞和原生质的培养技术。（植株植

4、株 培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、 细胞培养、原生质体培养细胞培养、原生质体培养 ） 石斛植物的芽培养 长春花的胚性细胞培养 黄芪的发状根固体培养 黄芪发状根的液体培养 5 5、植物组织培养中的重要概念、植物组织培养中的重要概念 愈伤组织：愈伤组织：指由植物的一种组织或器官指由植物的一种组织或器官 经历脱分化形成的原始胚样组织，它具经历脱分化形成的原始胚样组织，它具 有再分化成为完整植物体的潜能；有再分化成为完整植物体的潜能； 外植体：外植体：植物组织培养中用来进行无菌植物组织培养中用来进行无菌 培养的离体材料，可以是器官、组织、培养的离体材料，可以是

5、器官、组织、 细胞和原生质体等；细胞和原生质体等； 无菌和消毒：无菌和消毒： 烟草愈伤组织 诱导一周的烟草愈伤组织 长春花的胚性细胞培养 三三 实验材料实验材料 烟草（烟草（Nicotiana）属茄科植物，是重要）属茄科植物，是重要 的工业原料，是组织培养中研究的最为广的工业原料，是组织培养中研究的最为广 泛的植物材料。泛的植物材料。 豌豆（豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是）属豆科植物，是 粮食、饲料和重要的蔬菜作物，豌豆的根、粮食、饲料和重要的蔬菜作物，豌豆的根、 茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植 体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、

6、体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、 幼叶等器官可成功的再生成植株幼叶等器官可成功的再生成植株。 四四 实验要求实验要求 1、实验开始前，值日生将地板拖洗一、实验开始前，值日生将地板拖洗一 遍，所有同学将自己的实验台擦洗一遍，遍，所有同学将自己的实验台擦洗一遍， 同组两位同学请先认真研究好实验步骤，同组两位同学请先认真研究好实验步骤， 明确合作和分工，以加快实验速度，减明确合作和分工，以加快实验速度，减 少染菌机会，实验开始后，请尽量不要少染菌机会，实验开始后，请尽量不要 走动，有事请举手。走动，有事请举手。 2、无菌操作要注意：每次操作、无菌操作要注意：每次操作 前，将双手用酒精棉球擦拭消

7、毒；前，将双手用酒精棉球擦拭消毒； 解剖针、解剖刀等金属工具用火焰解剖针、解剖刀等金属工具用火焰 烧过灭菌，在酒精中冷却，再将酒烧过灭菌，在酒精中冷却，再将酒 精烧去方可使用；尽量减少无菌三精烧去方可使用；尽量减少无菌三 角瓶和培养皿在空气中的暴露时间；角瓶和培养皿在空气中的暴露时间； 所有无菌操作尽量快速完成，并请所有无菌操作尽量快速完成，并请 在酒精灯附近进行。在酒精灯附近进行。 3、请先用带菌豌豆练习茎尖解、请先用带菌豌豆练习茎尖解 剖，经检查无误，操作熟练后，再剖，经检查无误，操作熟练后，再 进行无菌解剖及接种，以减少植物进行无菌解剖及接种，以减少植物 材料染菌或失水死亡的机率。材料染

8、菌或失水死亡的机率。 五五 实验内容实验内容 . .烟草无菌苗的快速切繁烟草无菌苗的快速切繁继代继代 培养培养 . .烟草的愈伤组织培养烟草的愈伤组织培养 . .豌豆苗的茎尖培养豌豆苗的茎尖培养 一、烟草无菌苗的快速切繁一、烟草无菌苗的快速切繁 1 1、点着酒精灯，双手擦拭消毒，打开长有无菌烟草苗的、点着酒精灯，双手擦拭消毒，打开长有无菌烟草苗的 三角瓶，三角瓶瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭三角瓶，三角瓶瓶口使用前后需在酒精灯外焰上烧过灭 菌。菌。 2 2、用灭菌的镊子轻轻捏出幼苗，放在无菌的培养皿中，、用灭菌的镊子轻轻捏出幼苗，放在无菌的培养皿中， 用灭菌的剪刀将主茎剪成若干用灭菌的剪刀

9、将主茎剪成若干0.5-1cm0.5-1cm的小段，要求每的小段，要求每 段至少包含一个生长点，接入盛有段至少包含一个生长点，接入盛有MSMS培养基的三角瓶中，培养基的三角瓶中， 每一个切段必须直接接触培养基，三角瓶口重新烧过灭每一个切段必须直接接触培养基，三角瓶口重新烧过灭 菌，并重新封好。菌，并重新封好。 3 3、在光照培养箱中，、在光照培养箱中，2525，1616小时光照条件下培养小时光照条件下培养4 4周，周， 可长成完整植株。可长成完整植株。 1、点着酒精灯 2、双手擦拭消毒 3、剪刀灭菌 外焰 4、酒精中冷却 5、把酒精烧去 6、打开三角瓶铝箔纸的拿法a 7、打开三角瓶铝箔纸的拿法b

10、 8、瓶口在火焰上烧过 9、铝箔纸的放法 10、镊出烟草苗a 11、镊出烟草苗b 12、放入培养皿中 13、烟草幼苗形态生长点 14、剪取茎段 15、剪好的烟草苗 培养皿的拿法 16、烟草茎段接种a 17、烟草茎段接种b 18、接种好的烟草苗a 19、接种好的烟草苗b 20、重新封好瓶口a 21、重新封好瓶口b 22、重新封好瓶口c 23、重新封好瓶口d 24、写好班级和组号 二二 烟草愈伤组织的培养烟草愈伤组织的培养 、挑选生长健康的无菌烟草叶或茎，、挑选生长健康的无菌烟草叶或茎， 在灭菌的培养皿中在灭菌的培养皿中剪成剪成0.5-1cm0.5-1cm2 2 的小块或相当大小的茎段的小块或相当

11、大小的茎段( (造成伤造成伤 口口), ), 接种在盛有接种在盛有MSMS培养基的培养培养基的培养 皿中皿中将培养皿用封口膜封住。将培养皿用封口膜封住。 、在光照培养箱中，、在光照培养箱中，2525下下,16,16小小 时光照，培养两周，可形成愈伤组时光照，培养两周，可形成愈伤组 织。织。 1、将烟草苗剪出伤口 2、剪好的烟草叶片和茎段 3、打开培养皿 4、烟草愈伤组织接种a 5、烟草愈伤组织接种b 6、培养皿封口 7、写好班级和组号 8、酒精灯熄灯法a 9、酒精灯熄灯法b 三、豌豆苗的茎尖培养三、豌豆苗的茎尖培养 、取豌豆幼苗10株，剪取1cm左右的茎尖浸入70%的 酒精1分钟消毒液中15分

12、钟无菌水冲洗5次灭菌的 滤纸上吸干放入灭菌的培养皿。 、在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长 锥，挑取带着两至三个叶原基的生长锥。移到盛有B5 培养基的培育皿中，诱导愈伤组织形成，用封口膜将培 养皿封好。 、在恒温培养箱中，26下,培养六周，可形成簇生芽 丛。 1、豌豆幼苗形态 2、剪取豌豆茎尖 茎尖 3、剪好的豌豆茎尖 4、倒入70%酒精处理1分钟 5、倒去酒精 6、倒入消毒液处理15分钟 7、倒去消毒液 8、无菌水冲洗5次 9、取出茎尖 10、在滤纸上吸干水分 11、双目解剖镜下解剖豌豆茎尖 显微解剖镜使用图解 目 镜 放大倍数 旋钮 物镜 解剖载物台 焦距旋钮 底光源开关 上光源调节 旋钮 六、实验结果观察六、实验结果观察 1、两周以后观察烟草愈伤组织的形