基因重组与基因工程

1、 五、基因重组与基因工程 （一）重组DNADNA技术的基础 （二）重组DNADNA技术的基本操作过程 （三）重组DNADNA技术的应用 （一）重组DNADNA技术的基础 重组DNADNA技术的定义 在体外，将一种外源DNADNA和载体DNADNA重新组合连 接，形成杂交DNADNA，然后将其转入宿主细胞，最终 使外源DNADNA在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增 殖和表达, ,从而改变生物原有遗传性状的过程，称 为重组DNADNA技术。 它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因， 最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为 “遗传工程” ，亦即“基因工程” 。 1. 1.重组DNADNA技术的

2、基础 ( (1) 1) 重要的工具酶 (2) (2) 载体 （1 1）重要的工具酶 它能够识别、切割双链DNADNA分子中的特定 序列，这些特定序列多数为反向重复序列， 一般长度是4 4、5 5或6bp6bp。 限制性内切酶 粘性末端 如 EcoR I: 5 -GAATTC CTTAAG-3 平齐末端 如 HaeIII: 5 -GGCC CCGG-3 P GAATTCQ PCTTAAGQ XGAATTCY XCTTAAGY AATTCQ PG PCTTAAGQ XGAATTCY XCTTAAGY PCTTAA PGAATTCY GYXCTTAA XG GQ AATTCQ EcoR1限制性酶酶切

3、 片段退火与DNA连接酶连接 DNA DNA连接酶 目前使用的连接酶有两种： 大肠杆菌DNADNA连接酶 黏性末端连接； T T4 4 连接酶 黏性和平齐末端连接。 （2 2）载体 概 念 能将外源DNADNA带入宿主细胞，进行复制扩增或最 终使外源基因得以表达的自主 DNADNA，称为载体 （vectorvector）。 分 类 克隆载体 用于基因的复制、扩增、测序等； 表达载体 用于目的基因的表达。 （二）重组DNADNA技术的基本操作过程 1.1.目的基因的获得 2.2.选择和制备载体 3.3.将目的基因与载体进行切割连接 4.4.将重组体导入受体细胞 5.5.阳性克隆的筛选和鉴定 6.

4、DNA6.DNA重组体的扩增、表达等研究 重组DNA技术的基本操作过程 1. 1.目的基因的获得 （1 1）提取DNADNA后，PCRPCR体外特异扩增 （2 2）以mRNAmRNA为模板，反转录合成cDNAcDNA。 （3 3）化学合成基因 （4 4）限制性内切酶从载体上切取 （5 5）构建基因文库，调取目的基因 2. 2.载体的选择和制备 原核生物常用的载体：质粒和噬菌体； 真核生物常用的载体：动物病毒、酵母； 穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞中繁殖 又能在原核细胞中繁殖的载体。 目的基因与载体的酶切与连接 3. 4.4.重组DNADNA导入宿主细胞 大肠杆菌、酵母、真菌及各 种真核细

5、胞、受精卵细胞都 可用于重组。 转化 转染 - 5. 5.目的基因的筛选和鉴定 （1 1）遗传学方法 （2 2）核酸杂交法 （3 3）PCRPCR方法 （4 4）酶切鉴定 （1 1）遗传学方法 利用载体的特殊标记 如质粒含有抗青霉素的 基因，当含外源DNADNA的质粒转化后可在含有青霉 素的培养基中生长，而未转入质粒的细菌在同样 的条件下不能生长。 （2 2）核酸杂交法 菌落原位杂交 2 3 6 2 6 （3）多聚酶链式反应 20 20世纪8080年代末发展起来的一种DNADNA特定片段 体外快速合成扩增的方法，称多聚酶链式反应 （polymerase chain reactionpolyme

6、rase chain reaction，PCRPCR）。PCRPCR技 术具有高度的灵敏性和特异性，能在极短的时 间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖 凝胶电泳，可以直接观察产物的存在。因此， PCRPCR技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需 制备DNADNA。 （4 4） 酶切鉴定 目 的 基 因 表 达 6. （三）重组DNADNA技术的应用 1. 1.DNADNA指纹技术 2.2.转基因动物与动物克隆 3.3.基因诊断与基因治疗 1.DNA 1.DNA指纹技术 DNA DNA指纹( DNA fingerprint )( DNA fingerprint )技术是20 20 世纪 70

7、70年代末发展起来的遗传标记的方法。 遗传标记（genetic markergenetic marker）是指可用来区分 不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质。 生物个体间的差异在本质上是 DNADNA的差异，因 此DNADNA是最可靠的遗传标记。 （1 1）限制性片段长度多态性 真核生物的DNADNA分子很长，在遗 传过程中DNADNA碱基由于替换、重排、 插入、缺失等原因，在子代DNADNA中 会引起差异形成多态性。 当用一种限制性内切酶去切DNADNA 时，DNADNA分子会降解成许多长短不 等的片段，个体间这些片段是特异 的，可以作为某一DNADNA（生物）的 标记，将这种方法称为限

8、制性片段 长度多态性（restriction restriction fragment length polymorphismfragment length polymorphism， RFLPRFLP）。 F1 人 的 指 纹 分 析 示 意 图 F1 人 的 指 纹 分 析 示 意 图 个体 1个体 2 在人体DNADNA文库中发现的由9 970bp70bp重复单位串联 重复排列而成的高变异区，称为小卫星DNADNA （minisatellite DNAminisatellite DNA）。不同个体的多态性来源 于重复单位的重复次数不同，同一家族小卫星重复 单位含有相同或相似的核心序列，用

9、某一小卫星 DNADNA作探针，可与同一或不同物种多酶切DNADNA片段杂 交，获得DNADNA指纹图谱（DNA fingerprintDNA fingerprint）。 所有真核生物基因组中还存在由2-6bp2-6bp为重复单 位的重复顺序，因其重复单位比小卫星短，称为微 卫星DNADNA（microsatellite DNAmicrosatellite DNA）。 真核生物的小卫星DNA DNA 人的DNA 指纹图谱 F1 人 的 指 纹 分 析 示 意 图 （2 2）随机扩增多态性DNADNA 随机扩增多态性DNA DNA （Randomly Amplified Randomly Amp

10、lified polymorphic DNA polymorphic DNA，RAPDRAPD）， 又称随机引物PCRPCR。是以9 91010 个核苷酸的随机序列作引物， 以基因组DNADNA为模板进行PCRPCR 扩增。产物电泳后紫外观察， 不同个体的图带差异明显， 如DNADNA指纹图谱一样。 F1 人 的 指 纹 分 析 示 意 图 F1 人 的 指 纹 分 析 示 意 图 个体 1个体 2 2. 2.转基因动物与动物克隆 （1 1）转基因动物 （2 2）体细胞克隆无性繁殖 1982 年，人们将大白 鼠的生长激素基因放在 质粒中小白鼠金属巯基 蛋白启动子之后 。 将重组好的这种质粒，

11、用特制的微量注射器注 入小鼠受精卵的雄性原 细胞核中，再将这个受 精卵植入小鼠子宫中。 （1）转基因动物 启动子 结果为发育成 熟的小鼠体重比对 照小鼠大两倍，成 为“硕鼠”或“超 级鼠”。 1986 年，美国制备 出转生长激素基因的猪。 这种猪生长快，饲料转 换率和瘦肉率显著提高 而肥膘低，与注射生长 激素的效果相同。 我国现制备出转基 因猪、羊、兔等。 然而，转生长激素基 因的猪生殖能力明显下 降，不能繁殖扩群。 1996 年 7 月世 界第一例从成年 动物体细胞，克 隆出的哺乳动物 绵羊“多利”诞生。 1997年2月 Nature杂志报道 将这个秘密向世人 公布。 （2 2）体细胞克隆无

12、性繁殖 克 隆 羊 多 利 的 产 生 过 程 多利羊之父 威尔穆特教授 英国爱丁堡 罗斯林研究所， 苏格兰胚胎学 家。 1998年 克隆批量化 美国克隆出5050 多只老鼠。 日本克隆出8 8 只完全一样的小 牛。 美国俄 勒冈州 沃尔小 组成功 克隆两 只恒河 猴。 2000 2000年人类的近亲被克隆 克隆猪 同年，帮助培育出多利羊的生物技术 公司克隆出5 5只小猪仔，并宣称克隆猪终将成为 人类移植器官的“加工厂”，生产器官包括角膜、 皮肤、肾、肝 、肺、心脏等。 珍稀濒危动物的繁殖 克隆大熊猫的实验已开 始报道。 2001 2001年至今关于克隆人 关于克隆人的问题争论的很激烈，在理论上， 利用同样方法，人可以克隆人，但各国至今还不 允许克隆人。 20012001年，美、意科学家联手展开克隆人体胚胎 的工作。1111月，美国科学家宣布首 次克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎， 称其目标是为病人“定制”出不会诱发排异 反应的人体细胞用于移植。 2004 2004年8 8月1111日英国颁发全球首张“克隆 人类胚胎”执照，合法执照有效期为一年，胚 胎1