血液凝固调节系统课件

1、血液凝固调节系统1 血液凝固调节系统 血液凝固调节系统2 对血液凝固系统的调节，使其改变凝血性质，减 少纤维蛋白的形成、降低各种凝血因子的活化水平 就是抗血液凝固作用。与此作用相关的生理性物质 组成了抗血液凝固系统。在其中应该包括血管内皮 细胞合成分泌抗凝物质、光滑内皮阻止血小板活化 和纤维蛋白的沉积的抗凝作用，以及单核-巨噬细胞 对活化凝血因子消除作用的抗凝功能体现。但这种 细胞承担的抗凝作用机制不明，目前的检测技术不 足以说明细胞抗凝能与生理性抗凝蛋白作用相比。 因此，本节主要阐述血液中生理抗凝蛋白的作用和 特性。广义上，对纤维蛋白的降解以及有关酶类对 活化凝血因子的消除都是对血液凝固的调

2、节。因此， 纤溶系统也可算作抗凝系统的一部分。 血液凝固调节系统3 生理性抗凝蛋白（1） 抗凝血酶 抗凝血酶（antithrombin， AT）是主要的生理 性血浆抗凝物质，尤其对凝血酶的灭活能力占 所有抗凝蛋白的70%80%。 AT与丝氨酸蛋白酶作用的活性位点位于 Arg393-Ser394处，蛋白酶攻击该键使其裂解并 引起AT变构，从而形成AT与酶1：1复合物， 这种共价结合是不可逆的，但能被肝素或硫酸 乙酰肝素（heparan sulfate）大大加强。AT与 其他丝氨酸蛋白酶抑制物如1-AT、2-AP、 HC-II、Nexin及PAI等在氨基酸序列结构上具有 同源性。 血液凝固调节系统

3、4 肝素和抗凝血酶的抑酶作用 Heparin Antithrombin Thrombin 血液凝固调节系统5 除肝以外，其他脏器如肺、脾、肾、心、肠、 脑等也有合成AT的能力，血管内皮细胞、巨核细 胞也是AT的合成场所。 AT的抑酶谱很广，除凝血酶外，它还能抑制凝 血因子Xa、IXa、Xla、XIIa以及纤溶酶、胰蛋白 酶、激肽释放酶等。作用机制都是相同的，通过 形成1：1共价复合物而灭活这些活性因子或蛋白 酶。肝素作用于AT的赖氨酸残基从而大大增强AT 的抗凝酶活性（2000倍以上）。利用培养的J82 细胞研究发现，AT -heparin可有效抑制VIIa/TF 复合物，这一作用甚至可被因子

4、X和XI加强，已 证明这种抑制并不是由TFPI所引起的，也不需要 Xa的活性丝氨酸残基。 血液凝固调节系统6 AT缺乏是发生静脉血栓与肺栓塞的常 见原因之一，但与动脉血栓形成关系不 大。目前对先天性AT缺乏的分子机制研 究报道很多，获得性AT缺乏一般因合成 障碍（如肝受损）或消耗过度（DIC、脓 毒血症、深静脉血栓、急性早幼粒细胞 白血病等）所致。 血液凝固调节系统7 生理性抗凝蛋白（2） 蛋白C系统 目前认为蛋白C系统除蛋白C（protein C，PC）外，还包括蛋白S（protein S， PS）、血栓调节蛋白（thrombomodulin， TM）和内皮细胞蛋白C受体（endotheli

5、al protein C receptor，EPCR）。 血液凝固调节系统8 PC由肝细胞合成，是一个依赖维生素K的蛋白质，因此与 凝血因子IX、X及凝血酶原等有很高的同源性，分子结构分 为羧基谷氨酸区（Gla区），EGF区（PC有两个EGF结构） 及含有活性位点的丝氨酸蛋白酶区段。 PS也是由肝细胞合成的依赖维生素K的蛋白质，PS是维 生素K蛋白质中碱性最大的一种。人类PS有10个羧基谷氨 酸残基（牛PS有11个），此外分子中还有1个很短的凝血酶 敏感区和4个EGF样结构。 TM是一相对分子质量为74000的单链糖蛋白，与PC分子具 有同源性，EGF区（共6个，236aa，凝血酶的结合点即位

6、于 该区）、SerThr富含区（34aa）、跨膜区（23aa）、C端为 38aa的胞内区。已知TM存在于除脑血管外的所有血管内皮细 胞中，淋巴管内皮细胞、成骨细胞、血小板、原始巨核细胞 系及循环单核细胞中也有发现，但其合成场所目前还不能肯 定。人血及尿中还存在一种相对分子质量略低于细胞型TM的 可溶性TM。 血液凝固调节系统9 内皮细胞蛋白C受体 自从1994首先在 内皮细胞表面发现存在一种穿膜的蛋白 受体，它可以影响活化蛋白C的活性，并 对整个蛋白C调节血液凝固作用有作用。 迄今对这种被称为EPCR的物质还不太了 解。但有几点是可以肯定的：由内皮 细胞合成；贮存于内皮细胞胞质中； 在炎性反应

7、时可表达内皮细胞表面； 在胚胎细胞中就可检测出EPCR的基因。 血液凝固调节系统10 蛋白蛋白 C 的抗凝途径的抗凝途径 Blood Flow Thrombomodulin Protein C APC 损伤处下游的抗凝作用损伤处下游的抗凝作用 Thrombin Thrombin Thrombus 血管损伤处发生的血栓血管损伤处发生的血栓 EPCR 血液凝固调节系统11 VIIIai 蛋白蛋白 C 的主要抗凝作用的主要抗凝作用 Blood Flow VIIIa Va Thrombus Vai APC APC PS PS Factor V Leiden Vai 血液凝固调节系统12 血液凝固调节系

8、统13 蛋白C系统是微循环抗血栓形成的主要 血液凝固调节物质。蛋白C系统的活化随 着凝血酶的产生并与内皮细胞表面的血 栓调节蛋白TM形成复合物而启动。此时， 若内皮细胞表面表达了EPCR，则可与蛋 白C结合，结合于EPCR的蛋白C可被TM与 凝血酶复合物激活，使蛋白C切下12氨基 酸的多肽。（蛋白C肽，Protein C peptide， PCP）。 血液凝固调节系统14 生理性抗凝蛋白（3） 组织因子途径抑制物 TFPI是一单链糖蛋白，血浆含量为(54 142)g/L，均值100g/L。TFPI属于Kunitz 族丝氨酸蛋白酶抑制物，即分子中含有 Kunitz结构。这一族的典型分子是抑肽酶

9、（aprotinin）。除血浆中存在TFPI以外，血 小板的颗粒及溶酶体中也有TFPI，含量为 8g/L，是由巨核细胞合成的，血小板活化 后也会释放入血浆。此外，发现体内活化的 巨噬细胞可能合成TFPI。 血液凝固调节系统15 激活的VIIa非常稳定，即使在肝素存在 时，AT对它的灭活也很缓慢。已知TFPI 是主要的调节物。TFPI可以直接抑制活 化的X（Xa），并以依赖Xa的形式在Ca2+ 存在条件下抑制TF/VIIa复合物。 TFPI对Xa的抑制通过形成1：1复合物 的形式来实现，这步不需要Ca2+参与。但 TFPI结合于Xa的活性中心，形成TFPI-Xa 后，需在Ca2+存在下与TF/V

10、IIa形成多元 复合物。在这种结合中，Xa的富含梭 基谷氨酸区域（Gla区）是不可缺少的， 因此这是Ca2+的结合位点。 血液凝固调节系统16 TFPI抑制谱不很广，除抑制Xa及TF/VIIa 外，还能抑制胰蛋白酶，对纤溶酶及糜 蛋白酶也有轻微抑制，但不抑制凝血酶， 活化蛋白C、t-PA等。 血液凝固调节系统17 组织因子途径抑制物（组织因子途径抑制物（TFPITFPI）与凝血）与凝血 因子因子XaXa（FXaFXa）的机制）的机制 TFPI+FXaTFPI-FXa复合物 TF，FVIIa TFPIFXa/TFFVIIa四聚体 FXa，FVIIa被灭活 血液凝固调节系统18 血液凝固调节系统1

11、9 生理性抗凝蛋白（4） 蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物 PZ是一种维生素K依赖的糖蛋白，由肝脏合成分泌 后进入循环血液中。与其他维生素K依赖的因子一样 具有 Gla残基，在结构上与因子VII、IX、X和蛋白C 极为相似。华法令可使PZ水平下降到正常时的15%以 下；DIC、肝病、骨髓纤维化以及新生儿的PZ水平都 是很低的。而凝血酶可以与PZ结合也可以将PZ裂解。 ZPI是一种丝氨酸蛋白酶，相对分子质量为72000， 由肝脏合成分泌。与别的氨基酸蛋白酶存在25% 35%的相同构形，与大鼠的存在87%的同源性。ZPI 在血液凝固或血栓形成时会大量消耗。 血液凝固调节系统20 在这两个调节蛋白中

12、，较早发现有血液凝固 调节作用的是PZ。比较明确的实验是检测血浆 或者因子Xa与PZ孵育后，因子X活性会明显下 降。这种作用在磷脂和Ca2+的存在时变得更加 明显。这种现象可以解释为PZ与因子Xa在磷脂 表面存在一种反应，而这种反应的结果是使因 子Xa失活。 在以后的研究中进一步证实，ZPI在PZ的协 助下，可形成Xa-ZPI-PZ复合物而使因子Xa在1 min内失去95%以上的凝血活性。 血液凝固调节系统21 蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物 的抗凝机制 血液凝固调节系统22 纤维蛋白溶解系统 纤维蛋白溶解系统（fibrinolytic system） 简称纤溶系统，是指纤溶酶原经特异性激活

13、物 使其转化为纤溶酶（plasmin，PL），以及PL 降解纤维蛋白和其它蛋白质的过程。纤溶过程 是一系列蛋白酶催化的连锁反应，是正常人体 的重要生理功能，它与血液凝固存在着既矛盾 而又统一的动态平衡关系，其主要作用是将沉 积在血管内外的纤维蛋白溶解而保持血管畅通， 防止血栓形成或使已形成的血栓溶解，血流复 通。 血液凝固调节系统23 纤维蛋白溶解系统（1） 纤溶活性物质 纤溶酶原（plasminogen，PLG）是一种单链糖 蛋白，主要由肝脏合成而分泌入血。根据纤溶酶原 含糖量和结构的不同，可分为两种不同的类型。天 然纤溶酶原的N端是谷氨酸，故称为谷氨酸纤溶酶 原，它是由两条肽链组成，A链及

14、B链，由二硫键连 接。在少量纤溶酶的作用下，在N端切去一个短肽， 使N端为赖氨酸，称为赖氨酸纤溶酶原。赖氨酸纤 溶酶原被激活剂激活的效率极大，同时与纤维蛋白 的亲和力较高，因而能较迅速地转变为赖氨酸纤溶 酶，起到更有效的纤溶作用。 血液凝固调节系统24 组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）t-PA主要由 内皮细胞合成和释放，单核细胞、巨核 细胞及间皮细胞也产生一定量的t-PA。 游离状态的t-PA与PLG的亲和力低，只有 在t-PA、PLG和纤维蛋白三者形成复合体 后，才能有效地激活PLG转变成PL，从而 使纤维蛋白凝块溶解。 血液凝固调节

15、系统25 尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator u-PA）u-PA属丝氨酸蛋白 酶，是一种单链糖蛋白。u-PA主要由泌尿生殖 系统上皮细胞产生，血中浓度为（220） ng/ml。u-PA有两种类型，未活化的单链尿激 酶常称为scu-PA（single chain urokinogen type plasminogen activator, scu-PA），已 活化的双链尿激酶称为tcu-PA（two chains urokinogen type plasminogen activator, tcu-PA）。两种u-PA 均可以直接激活PLG，不

16、 需纤维蛋白作为辅因子，但scu-PA对纤溶系统 的激活较tcu-PA为弱。 血液凝固调节系统26 纤溶酶（plasmin,PL）PL是由PLG经PA作用， 使PLG活化、裂解后所产生的。单链PLG在t-PA 或u-PA的作用下，在其精氨酸560-缬氨酸561 之间的肽键断裂，形成双链PL，一条为重链 （相对分子质量为60000），另一条为轻链 （相对分子质量为25000），活性中心位于轻 链部分。PL是一种活性较强的丝氨酸蛋白酶， 其主要作用为 降解纤维蛋白原和纤维蛋白； 水解各种凝血因子（、）； 分解血浆蛋白和补体；可将单链t-PA、单 链u-PA转变为双链t-PA、u-PA；将谷氨酸 P

17、LG转变为赖氨酸PLG；可降解GPb、 GPb/a激活转化生长因子，降解纤维连 接蛋白，TSP等各种基质蛋白质。 血液凝固调节系统27 纤维蛋白溶解系统（2） 纤溶抑制物 纤溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor，PAI-1） PAI-1是一种 单链糖蛋白，含有379个氨基酸，相对分 子质量为52000，其q21-22之间，全长约 12.2Kb。PAI-1主要由血管内皮细胞和血 小板合成，正常人血浆中浓度为5 85g/L。它主要作用是与u-PA或t-PA结 合形成不稳定的复合物，使它们失去活 性，其次也可抑制凝血酶Fa、Fa、K 和APC的活性。

18、血液凝固调节系统28 纤溶酶原激活抑制物-2（plasminogen activator inhibitor，PAI-2） PAI-2是一种糖蛋 白，含有415个氨基酸，其基因位于18 q21-23， 基因全长16.5Kb。PAI-2最早是从人胎盘中提取 的，其它如白细胞、单核细胞、巨噬细胞也能 合成PAI-2。正常人血浆中浓度极低，5g/L。 妇女妊娠期间逐渐升高，分娩后1周降至检测 不到水平。PAI-2有两种类型，一种为非糖基化 型（低相对分子质量型），相对分子质量为 46000；另一种为糖基化型（高相对分子质量 型），相对分子质量为70000。PAI-2的主要作 用是有效地抑制tct-P

19、A、tcu-PA，在正常妊娠时 调节纤溶活性。 血液凝固调节系统29 蛋白C抑制物（protein C inhibitor, PCI） PCI是一种相对分子质量为57000的单链 糖蛋白，由肝脏合成或释放，能有效地 抑制APC，故又称为APC抑制物 （ACPI）。正常人血浆中浓度为5mg/L。 PCI能与以丝氨酸为活性中心的蛋白酶形 成1：1的复合物，使蛋白酶失活。 也有人称起为3型纤溶酶原激活抑制 物。 血液凝固调节系统30 2-抗纤溶酶（2-antiplasmin, 2-AP） 2-AP又称2-纤溶酶抑制物（2- plasmin inhibitor, 2-PI）,是一种单链糖蛋白，含有45

20、2 个氨基酸，相对分子质量为67000。2-AP主 要由肝脏合成或释放，正常人血浆中浓度为 1mol/L。2-AP以两种形式存在于血循环中， 一种能与PL结合，约占总2-AP的70%，另一 种为非纤溶酶结合型，无抑制功能。2-AP的 主要功能是抑制PL、凝血因子（Fa、Fa、 Fa）、胰蛋白酶、激肽释放酶等以丝氨酸为 活性中心的蛋白酶，其发挥作用的机理为： 与PL以1:1的比例形成复合物；FXIIIa使2- AP以共价键与纤维蛋白结合，减弱纤维蛋白对 PL作用敏感性。 血液凝固调节系统31 2-巨球蛋白（2-macroglobulin, 2-MG） 2-MG是一种二聚体糖蛋白， 由两个完全相同

21、的亚基所组成，总相对 分子质量为725000。每个亚基含有1451 个氨基酸。2-MG主要由肝脏和巨噬细 胞产生，正常血浆中浓度为25mol/L。 2-MG有两个功能区，易裂区（bait region）和硫醇酯区，是一种广谱的蛋白 酶抑制物，可与PL结合形成复合物而使 PL灭活。 血液凝固调节系统32 纤维蛋白溶解系统（3） 纤溶的作用和产物 1内激活途径 主要是通过内源凝血系统的有关因子 裂解PLG形成PL的过程。F经接触激活成为Fa， 后者使PK转变为激肽释放酶，激肽释放酶能激活 PLG为PL，此是继发时纤溶理论基础。 2外激活途径 主要是指t-PA和u-PA使PLG转变为PL 的过程，t

22、-PA和u-PA受PAI-1及PAI-2的抑制，它们之 间的作用，激活、抑制调节着纤溶系统，此是原发 性纤溶的理论基础。 3外源性激活途径 药物依赖途径，激活纤溶系统 的制剂如SK、UK、重组t-PA注入体内，使PLG转变 成PL，此是溶栓治疗的理论基础。 血液凝固调节系统33 血液凝固调节系统34 纤维蛋白原的降解 PL作用于Fg，并从Fg的 B链上裂解下来一个小肽B1-42，再从A链 上裂解下来的一种极附属物（碎片A、B、C） 留下的片段称为X片段（相对分子质量250000）， X片段继续被PL作用，裂解为D片段（相对分子 质量100000）及Y片段，Y片段再进一步被裂解 为D和E片段（相

23、对分子质量为50000），故Fg在 PL的作用下产生降解产物，是由X、Y、D、E、 B1-42和极附属物A、B、C、H碎片组成，统称 为纤维蛋白原降解产物（FgDP）。 血液凝固调节系统35 可溶性纤维蛋白的降解 Fg在凝血酶的 作用下，分别从A链及B链裂解下纤维 蛋白肽A（fibrin peptide A, FPA）（A1-16） 和纤维蛋白肽B（fibrin peptide B, FPB） （B1-14），形成纤维蛋白和（可溶 性纤维蛋白单体）。Fb-在PL的作用下， 先从其B链上裂解出小肽B1-42，再从其 A链裂解出A、B、C、H极附属物，最终 形成X、Y、D和E。在PL的作用下Fb-

24、 中B链被裂解释放出肽B15-42，然后又 从A链裂解出A、B、C、H极附属物，最 终也降解出X 、Y 、D和E 碎片。 血液凝固调节系统36 交联性纤维蛋白的降解 Fb-和Fb- 可自行发生聚合，经因子XIIIa作用而形成 交联的纤维蛋白。后者在PL的作用下，形 成X，Y，D，E碎片外，还生成D-二聚体 和-二聚体、A链的附属物（碎片A、B、 C、H）、复合物1（DD/E），复合物2 （DY/YD）和复合物3（YY/DXD）等。这 些产物统称为纤维蛋白降解产物（fibrin degradation products, FbDP）。 血液凝固调节系统37 血液凝固调节系统38 Fg降解产物（F

25、gDP）和纤维蛋白降解产 物（FbDP）统称为纤维蛋白（原）降解产 物（FDPs）。FDPs对血液凝固和血小板的 功能均有一定的影响。其中所有的碎片均 可抑制血小板的聚集和释放反应。碎片 （X）因与可溶性纤维蛋白单体结构相似， 故可与Fg竞争凝血酶，并可与FM形成复合 物，以阻止FM的交联；碎片Y（Y）和D可 抑制纤维蛋白单体的聚合，碎片E可以抑制 凝血活酶的生成；极附属物A、B、C、H可 延长APTT及凝血时间。 血液凝固调节系统39 血液凝固调节系统检测 筛查试验 1.蛋白C Global 试验 2.活化蛋白C抵抗(APCR)试验 3.纤维蛋白降解产物(FDP)测定 4.D二聚体(DDim

26、er)测定 5.纤溶酶原(PLG)检测 血液凝固调节系统40 蛋白C Global试验 原理原理: 凝血酶（T）与血管内皮细胞表面的凝血 酶调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后 者使蛋白C（PC）形成活化蛋白C（APC）。 APC在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子Va和 因子VIIIa，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1 （PAI-1）使纤溶活性增强。此外，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代T-TM复合物直接激活PC， 使PC转化为APC，APC也受PCI的抑制 血液凝固调节系统41 检测方法：检测方法： 在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直 接激活PC转变为APC。随后加入A

27、PTT试剂以 检测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C activity-dependent clotting time，PCAT）。若 待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+后血 浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的 影响，本试验设计了对照组，即在试验过程 中以缓冲液代替PC激活剂，血浆不依赖PC活 性的血浆凝固时间（PCAT/O），其结果应短 于60秒。 血液凝固调节系统42 参考值参考值： PCAT为85200秒，PCAT/O为3355秒（n 234） 临床意义：临床意义： 本试验多用于蛋白C、蛋白S、FV Leiden突变和FII 20210 GA突变的检测， 起到蛋白C

28、系统筛选检测作用。 本试验也有假阳性，见于凝血因子V、VIII 活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物等。 血液凝固调节系统43 123450 1 2 3 各种凝固比值各种凝固比值 (m mg/ml) APTT PT RVVT 时间时间 Control Factor V Leiden APCR的实验示意图 血液凝固调节系统44 APCR APCR 对对 FVLeidenFVLeiden突变的筛查突变的筛查 APTT X seconds APTT + aPC Y seconds Y X正常 Y = X或Y X患者 血液凝固调节系统45 血清纤维蛋白（原）降解产物检测 【原理】 胶乳凝集法：在受检血清中

29、加入用特异性抗纤维蛋 白（原）D、E片段抗体标记的胶乳颗粒悬液，如果血清中含 有纤维蛋白（原）降解产物（FDP），特别是D、E片段，即 可发生抗原抗体反应，导致胶乳颗粒凝集。 【参考值】 血清FDP10g/ml 【临床评价】 本法具有快速、简便和可靠的优点，是国际上 最先选用的有关纤溶和DIC的检验方法。目前认为，血清FDP 的检测是诊断DIC的敏感和可靠指标之一。 1血清FDP轻度增高（1040g/ml） 常见于急性静脉 血栓、急性心肌梗死、严重肺炎、大手术后、恶性肿瘤和休 克等。 2血清FDP明显增高（40g/ml） 见于原发性纤溶 症、DIC、急性早幼粒细胞白血病及应用链激酶等溶栓治疗

30、时。 血液凝固调节系统46 血浆D-二聚体检测 【原理】 血浆D-二聚体（D-dimer,D-D）检测，常用下列两种方法： 1胶乳凝集法 受检血浆中加入标有D-二聚体单抗的胶乳颗粒悬液，如果 血浆中含高于0.5mg/L的D-二聚体，便与胶乳颗粒的抗体结合，此时胶乳 颗粒发生凝集。 2ELISA法 将D-二聚体单抗包被于酶标反应板，加入受检血浆，血浆中 的D-二聚体（抗原）与包被在反应板的D-二聚体抗体结合。然后再加酶标 记的D-二聚体抗体，与包被的D-二聚体结合。最后加入底物显色，显色的 深浅与血浆中D-二聚体的含量成正相关，所测得的A值可从标准曲线中计 算出血浆中D-二聚体的含量。 【参考值】 胶乳凝集法：阴性； ELISA法：小于400g/L。 【临床评价】 D-二聚体是交联纤维蛋白降解产物之一，为继发性纤溶之特 有代谢物，可作为原发性与继发性纤溶鉴别的可靠指标，同时也可作为溶 栓治疗有效的观察指标。其中胶乳凝集法方便、快速，是临床上经常采用 的D-二聚体定性试验，而ELISA法作为具有更敏感和精确的定量试验方法 之一。 1DIC时呈阳性或明显增高，是诊断DIC的重要依据之一。此外，在深静 脉