血液学及检验试验教学笔记

1、实验十三自溶+纠正、高铁血红蛋白还原试验、Coomb s试验实验一自身溶血试验及其纠正试验autohemolysis test and correcti ng test【目的】 掌握自溶+纠正、高铁血红蛋白还原试验、Coo mb s试验的RBC孵RBC因耗能，体积增大而破宅1.原理：方法及结果判断及临床应用正常人有轻微的溶HS、非遗传性球形RBC溶血性贫血，自身溶血孵 RBC能；RBC 供应正常“自身溶血不同程度纠葡萄糖、2. 器材和试剂：(1) 无菌 0.556mol/L ( 100g/l )葡萄糖液(2) 无菌N.S(3) 1g/l肝素水溶液(4) 氰化高铁Hb转化液(5) 无菌小瓶(5m

2、l)，内加0.3ml肝素，50C烘干灭菌(6) 无菌注射器和吸管3. 步骤和方法(1) 试管中加葡萄糖 20mg 109mol/L枸橼酸钠液0.2ml，血1.8ml(2) 125g离心5min,调血细胞：血浆为1： 1。(3) 取抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各0.5ml， 混匀，37C水浴3h。(4) 取血0.1ml，加磷酸盐缓冲液10ml，2min后，635nm比色得吸 光度为SA(5) 用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为Bo1J. I6-彳3I取 0.1ml+9.9mlHb血浆 0.2ml+4.8mlHb转化液转化液540nm比色，计算溶血率1 RBC 比容 1

3、 I=X测定管读数X 100未保温全血管读数X 4(% )注：未保温全血管稀释100倍，测定管稀释25倍，故乘以4。4. 临床意义：正常人：应75%杂合子：多在7431%纯合子：多V 30%5. 注意事项：RBC比积V 30%寸，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。 以ACD乍抗凝剂时，其与血液之比为1： 9,过量则pH下降。一般要求St比B大8倍以上。不稳定Hb易被氧化造成假阳性。(2)几种溶血性疾病的结果:疾病NaCI葡萄糖ATPHS明显纠正明显纠正G-6-PD缺乏正常or稍f部分纠正部分纠正HK缺乏稍f纠正纠正不稳定Hb病稍f纠正纠正PK缺乏fff不纠正明显纠正AIHA伴球形 RBC

4、增多f不定明显纠正实验二高铁血红蛋白还原试验methemogob in reducti on test MHb-RT1. 原理：当RBC内G6PD含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH可作为MHb的还原酶的辅酶，在美蓝的参与下，MHb被还原成Hb=如G6PD缺乏，还原速度减慢，或不能还原。通过测定还原速度间接反应G6PD勺活性。Hb ( Fe2+ )亚硝酸钠戶 MHb ( Fe3+ 厂+ Hb (Fe2+ )H美蓝2. 器材与试剂(1) 亚硝酸钠和葡萄糖混合液(2) 亚甲蓝(3) 磷酸盐缓冲液3. 方法及计算：(1) 试管中加葡萄糖20mg 109mol/L枸橼酸钠液0.2ml，血1.

5、8ml。125g离心5min,调血细胞：血浆为1： 1。(2) 取抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各0.5ml，混匀,37C水浴3h(3) 取血0.1ml，加磷酸盐缓冲液10ml, 2min后，635nm比色得吸光度为SA(4) 用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。4. 参考值：正常人：应75%杂合子：多在 7431%纯合子：多V 30%5. 注意事项：RBC比积V 30%寸，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。以ACD乍抗凝剂时，其与血液之比为1： 9,过量则pH下降。 一般要求St比B大8倍以上。不稳定Hb易被氧化造成假阳性。3. 临床意义：设问实验三抗人球蛋

6、白试验 Coombs test1. 原理：不完全抗体(IgG)在盐水介质中不能使 RBC凝集，只附着在RBC 上(致敏RBC，此种抗体是人类球蛋白，如果用家兔抗人球蛋白加入，可 使致敏RBC发生凝集。用于检测体内不完全抗体的试验。有间重接和直接试验 两种。2. 方法与步骤间接抗人球蛋白试验：检查血清中的不完全抗体D-RBC待检血清致敏RBC抗人球蛋白RBC凝集管号PDd待测患者血清2滴10%：D-RBC1滴1滴抗D血清1滴1滴10%Od- RBC1滴混匀，37C水育1h, 810倍生理盐水洗涤 3次以上，留压积 RBC加抗人球蛋白血清 滴，转动试管混匀，观察结果。P管凝集：血清中含有不完全抗体

7、。如检查孕妇血清中有无不完全抗体。直接抗人球蛋白试验：检查RBC上的不完全抗体RBC凝集RBC上有无来自母体的抗体。直接抗人球蛋白试验:已致敏RBC抗人球蛋白临床意义：C上含有不完全抗体。如检测新生儿脐血实验小结：实验十四 血小板功能试验，PF3aT试验检测一、血小板粘附试验(platelet adhension test，PAdT )常用方法：玻球法、玻璃滤器法、玻柱法BPL原理BPL可粘附于带负电荷的非生理性物质表面如金属、玻璃等血液在 特制的玻球内转动，BPL可粘附于玻璃球内表面一故血液在玻球内转动后 数比较转动前后血液中BPL数可了解BPL粘附功能。器材、试剂玻球、转动装置、显微镜、牛

8、鲍计数板、枸橼酸盐抗凝剂、血 小板稀释液等。操作1 .取血1.8ml + 0.2ml枸橼酸加入玻球旋转 3rpm/min x 15min2 计数粘附前后血小板数，算出粘附率。临床意义1、PAdT增高：见于血栓前状态和血栓性疾病。2、PAdT减低：见于血管性血友病、巨大 BPL综合征、BPL无力症、尿毒症、异 常蛋白血症、MDS AL等。参考值45.34% 79.78%、血小板聚集试验(platelet aggregation test ,PAgT光束原理透过的光PRP致聚剂致聚剂PRP光束记录光浊度变化血小板聚集曲线器材、试剂血液凝聚仪、血小板聚集诱导剂：3.0卩mol/L腺苷二磷酸钠盐 (A

9、DP、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素、花生四烯酸。临床意义1、增高：反映血小板聚集功能增强。见于血栓前状态和血栓性疾病。2、减低：反映血小板聚集功能减低。见于血小板无力症、贮存池病、尿毒症、 肝硬化等。BPL聚集分析参数：2 A 4 A MA TMA T50% Dt(,PF3aT、血小板第 3 因子有效性检测(platelet factor 3 acailability test记录凝固时间原理PF3是凝血的重要成分；当 PF3缺乏时复钙时间延长。本试验是利用 正人和病人PRP血浆以及PPP血浆相互配合，以白陶土作为活化剂测定各组标 本的RT比较各组差异而了解PF3有否缺陷。组别病人血浆mL正常人

10、血浆mL40%g/L白陶土悬 液(mL)PRPPPPPRPPPP10.10.10.220.10.10.230.10.10.240.10.10.2操作病 PRP1病 PPP2病 PPP3正 PPP4正PPP正 PRP病 PRP正 PRP忙_白陶土悬液临床意义 超过5秒为PF3有效性减低见于：BPL第3因子缺陷症、BPL无力症、巨大BPL 综合征等。参考值复钙时间1组较2组延长低于5秒四、实验小结：实验十五 PT、KPTT SCT XM因子筛选试验【目的】 掌握PT、KPTT SCT XM因子筛选试验的原理、方法及结果判断。一、硅化的凝血时间测定（SCT【原理】 由于本法采用硅化的用品，硅管内壁可

11、以阻止接触活化过程，故硅管 法的凝血时间较普通试管法为长。【器材】8mm直径玻璃试管（硅化管），灭菌注射器（硅化），水浴箱，秒 表，碘酊棉球，乙醇棉球。【操作】1. 准备试管 取8mm直径的硅化玻璃试管3支，编号为1、2、3,置于 37 r水浴箱中预温3min。2. 采血并计时 常规静脉采血3ml （自血液流入针头，即开始计时），去 掉针头后分别沿试管壁缓缓注入1ml血液于3支试管内，置于37C水浴中。3. 间隔计时3min后每间隔0.5min，将第1支试管倾斜1次（倾斜30 度），直至血液凝固。再观察第 2支试管，第2支试管血液凝固后再观察第 3 支试管。第3支试管血液凝固时，立即停止计时。

12、4. 计算 计算从血液进入针头到第 3支试管血液凝固所需要的时间，即 凝血时间。【注意事项】 硅管法的注意事项与试管法相同。【参考值】1532min。二、血浆凝血酶原时间测定（PT）【原理】 在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固的时间， 即为血浆凝血酶原时间（prothromb in time , PT ）。本试验是外源性凝血系 统常用的筛检试验。【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【试剂】1. 25mmol/L氯化钙凝血活酶试剂。商品试剂，用前按要求用蒸馏水溶解 混匀。2 .正常人冻干混合血浆。多为商品试剂，用25个以上正常人血液

13、经109mmol/L枸橼酸钠抗凝（血液与抗凝剂之比为9 : 1）, 3000r/min 离心10min,分离血浆后，混合分装为每瓶1ml,冻干保存。3. 109mmol/L枸橼酸钠溶液。【操作】1. 采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠 溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3000r/min离心10min,分离血 浆。2 .平衡温度将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆置室温中15mi n。3 .预温 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆、待测血浆，置 37C水浴中预温5min。4 .测定 取小试1支，加入正常人混合冻干血浆 0.1ml，3

14、7 T水浴预温 30s，再加入预温的25mmol/L氯化钙凝血活酶溶液 0.2ml，混匀，立即启动秒 表计时。5. 计时 不断地轻轻倾斜试管，观察试管内液体的流动情况，当液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，并记录所需时间。重复测定23次，取其平均值。6. 测定待测血浆以同样方法测定待测血浆的凝血酶原时间（重复23次测定，取其平均值）。7 .结果报告 以直接测定的时间（PT报告，同时，报告正常混合冻 干血浆PT。以PT比值（PTR报告，PTR待测血浆PT/正常人混合冻干血浆 PT。以国际标准化比值（INR）报告，INR=PTR （ISI为氯化钙凝血活酶试剂 国际敏感指数）。【注意事项】1 所用试管

15、必须洁净、干燥、无划痕。2 .采血要顺利，血液与抗凝剂比例（9 : 1）要准确。抗凝要充分，充分 混匀，决不能有血凝块。3. 采血后宜在1h内完成测定，4C冰箱内保存不应超过 4h, 20C下可 保存14d， 70C下可保存6个月。4 .先测定正常人混合冻干血浆的凝血酶原时间，其结果在正常允许范围 内后才能测定待测血浆。5. 水浴温度要控制在（37.0 0.5 ）C,温度过高或过低都可影响测定结 果。6. 血细胞比容（Het）小于0.2或大于0.5时，抗凝剂的用量应做调整。 抗凝剂（ml） = （100 Het）x血液（ml）x 0.00185。7 .由于每次使用的氯化钙凝血活酶活性不尽相同，

16、测定的条件也略变 动，故每次测定均需有正常对照。8.氯化钙凝血活酶必须注明国际敏感指数（ISI ）。【参考值】PT: 1113s （超过正常对照 3s有意义）。PTR 0.851.15。 INR: 0.8 1.5。三、活化部分凝血活酶时间测定【原理】 在37 r条件下，以白陶土（激活剂）激活幻、刘因子，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第 3因子，在参与下，测定血浆凝固所需的 时间。本试验是内源性凝血系统灵敏和常用的筛检试验。【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化玻璃试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊 棉球，乙醇棉球。【试剂】1. 109mmol/L枸橼酸钠溶液。2. APTT试剂（含白陶土或鞣酸及

17、脑磷脂）液体试剂混匀后可直接使用， 冻干试剂需用蒸馏水溶解再使用。3. 25mmol/L氯化钙溶液。4 .正常人混合冻干血浆多为商品试剂，用25个以上正常人血浆经109mmol/L枸橼酸钠溶液抗凝（血液与抗凝剂之比为9 ： 1），3000r/min离心10min,分离血浆后，混合分装为每瓶1ml,冻干保存。【操作】1. 采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠 溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3000r/min离心10min,分离血 浆。2. 平衡温度 用蒸馏水溶解正常人混合冻干血浆，于室温下静置15 min 以上，充分混匀。3 .预温活化 于试

18、管中加入正常人冻干血浆和APTT试剂各0.1ml，混匀，37C水浴中预温3 min，预温过程中，轻轻振摇数次。4. 加钙计时 于试管中加入预温至37E的25mmol/L氯化钙溶液0.1ml， 混匀，并立即计时，置水浴中不断振摇。20s后，不时地缓慢倾斜试管，观察 试管内液体的流动状态，当液体停止流动时停止计时，记录时间，重复检测23次，取平均值。5. 测定待测血浆 以同样方法测定待检血浆的 APTT（重复测定23 次, 取平均值）。【注意事项】1. 采血要顺利，血液与抗凝剂要充分混匀。2. 采血后应尽快检测，最迟不应超过2h。被检血浆放置过久，凝固时间 有缩短的倾向。3. 血浆加APTT式剂后预温时间不得少于 3min。4. 血液离心速度要达到 3 000r/min，时间为10min,以便尽可能除去血 小板。5. 活化剂因规格不一，其致活能力不同，因此参考值有差异。如果正常 人混合冻干血浆APTT明显延长，则提示APTT试剂质量不佳。6. 检测前应先测定正常人混合血浆，如果其APTT在允许范围内方能测定 待检标本。否则，应重新配制 APTT试剂。【参考值】25.0735.