宏基因组测序讲解

1、宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介宏基因组 （Metage nome）（也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome,或元基因组）。是由Handelsman等1998年提出的新 名词， 其定义为the genomes of the total microbiota found in nature, 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组 学（或元基因组

2、学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因 组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究 目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA,进行高通 量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。宏基因组 （Metage nome）（也称微生物环境基因组 Microbial Environmental Genome,或元基因组）。是由Handelsman等1998年提出的新 名词， 其定义为the genomes of the tota

3、l microbiota found in nature, 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组 学（或元基因组学，metagenomics）就是一种以环境样品中的微生物群体基因 组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA,进行高通 量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。特定生物种基因组研究使人们的认识

4、单元实现了从单一基因到基因集合的 转变，宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动 规律。在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组成为研究和开发的主要对象。细菌宏基因组细菌人工染色体文库筛选和基因系统学分析 使研究者能更有效地开发细菌基因资源，更深入地洞察细菌多样性。如宏基因组 成为生物催化剂的新来源。宏基因组学研究的策略和基本过程研究策略“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速 发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上， 是一种不依赖于人工培养的微生物 基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从

5、特定环境中直接分离所有微生物 DNA将大片段的DNA克隆到受体菌中表 达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。包括两个方面920:宏基因组文库的构建：宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方 法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般包括样品总DNA的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆17。宏基因组文库的筛选：根据其研究目的，宏基因组文 库筛选通常有功能 筛选(functional screening)和序列筛选(sequenee based screening) 两种方法。2宏基因组学的研究步骤基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组

6、 DNA克隆DNA到 合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等 4个步骤。特别要指出的是，在基 因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体(community)的混合基因组序 列。这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材 料。2.1分离特定环境生物DNA方法上不同于传统的先培养微生物再提取 DNA勺做法，而是首先直接收集能 够代表特定生物环境生物多样性的样品； 然后利用各种理化方法破碎微生物，使 其释放DNA再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。2.2纯化的大分子量DNA进行克隆在对DNA酶切或者

7、超声打断处理，并与合适的载体 DNA进行连接，构建重 组体。2.3将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的 无性繁殖系例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的 DNA在 模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。所有带有宏基因组 DNA载体的 模式微生物克隆构成宏基因组文库。2.4对宏基因组文库的DNA进行分析基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：一类为表型功能筛 选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。例如从文库中筛选能表达 抗菌物质的克隆。功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选， 可用于检测 编码新型酶的全部新基因或者获取新的

8、生物活性物质。另一类为序列基因型分 析，即对文库中所有或部分的 DNA进行测序分析，以应用于生态学研究。例如 分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。一个典型的宏 基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。3宏基因组学的技术方法宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活 性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基 因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对 常用方

9、法和技术予以简要介绍。3.1样品总DNA的提取及基因或基因组DNA勺富集提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类， 尽可能代表自然状 态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇45。所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。应严格操作，谨防污染，并且保持DNA片段的完整和纯度。已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍 致力于宏基因组DNA提取方法的改进68。常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法（细胞提取法）。直接裂解

10、法是将 环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法（如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等）和化学法、酶法等。不同直接裂解法的 提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。此法操作容易、成本低、DNA提取率高、 重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小（1-50kb），难以 完全去除酚类物质。细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出 来，然后采用较温和的方法抽提 DNA如先采用密度梯度离心分离微生物细胞， 然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA此法可获得大片段DNA（20-500kb）且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程

11、中可能 丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA也不容易抽提出来。为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率， 需要在克 隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集 9 11，一个比 较好的富集方法是稳定同位素示踪技术12。抑制性消减杂交技术13是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速 的分离差异基因的方法。该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、 证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。3.2宏基因组文库的建立宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。偏重于低拷贝、低丰度基

12、因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个 操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。基因文库的建立过程中需要选择合适的克 隆载体和宿主菌株。传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于 10kb。克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转 化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。 目前大肠杆菌是最为常用的宿主14，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建 文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。3.3宏基因组文库的筛选由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏

13、度的方法来筛选和 鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为四类：基于核酸序列差异分析； 基于目的克隆功能的特殊代谢活性；基于底物诱导基因的表达；基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。.3.1基于序列的筛选方法通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCF扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基 因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因1516。另一种方法是对含有16SrRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文 库随机测序17。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文

14、库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛 选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性， 也很难 获得全序列。直接序列分析法(sequenee driven screening method)是对所构建宏基因 组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息1820。也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人 力、物力及财力。虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比， 宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为 困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选

15、，可以很大程度上减少测序量和后续 的序列拼接等工作量。但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时， 除了其本身由 于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能 基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列 21 22。3.3.2基于功能的筛选方法功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文 库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋 白质和天然产物。功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进 行直接检测，如利用其在选择性培养基上(如

16、含有化学染料和不可溶的或发光的 酶反应底物)的表型特征进行筛选23。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到 较少的目的克隆。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条 件下功能互补生长的特性进行24。功能性筛选法的优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。不足之处是这种筛选方法 依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组 DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因 某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低， 工作量大，往往从上万个克隆中只能筛

17、选到几个有用的克隆。3.3.3 底物诱导基因表达筛选(substrateinduced geneexpressionscree ning, SIGEX)SIGEX是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因25。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈 簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。首先构建一个含有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，这个载体可将宏基因组 DNA克隆到GFF基因上游，使该基因的表达受到 宏基因组DNA片段中的启动子调控。当外加目标底物时，可以影响GFP的表达，进而通

18、过活细胞荧光分离技术 (fluorescenee activated cell sorting, FACS)，在添加特定底物的条件下对表达库进行筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性的克隆SIGEX在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测 手段，大大增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障， 而且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性；且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能。而SIGEX法的不足之处是目标基因的结构性和适应性很敏感，同时，无法用于分析不能进入细胞质的底物，而且FACS对进样设备的要求也比较高；代谢特定

19、底物的调控子和操 纵子在位置上不一定都相邻；同时有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基 因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。 但是考虑到宏基因组文库中含有大量的 基因，其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。所以只要对这 些不足之处进行优化，选择合适的条件，SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选 的有效方法，尤其适合于在工业上使用26。3.3.4基于稳定性同位素技术筛选方法具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素(stable isotope probing, SIP)。环境中的许多物质都可以用 SIP来标记，鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物27。3.3.5荧光原位杂交技术荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微 镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后