流式细胞仪操作规程-SOP

1、流式细胞仪操作规程目录1:淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3： HLA-B27 测定4： CD55 / CD59 测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN- V /IL-4测定38：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定（流式细胞仪）医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版（共3页）本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月_日文件分发部门和/或个人 院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细

2、胞亚群测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter, 贝克曼库 尔特）原理：双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中， 与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式 细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可 得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+； B淋巴细胞: CD3-, CD19+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+； NK细胞：CD3-CD16+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞 仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，

3、利用计算机软件计算出淋巴细胞 亚群的百分数，加入 Flow-Count 组会自动得岀绝对计数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量lmlo2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X107L,应分离单个核细胞。试剂品牌剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体28C（CD45/4/8/3CD45/56/19/3CD4/8/3 同型对照 IgGl/IgGl/IgGlCD3/19CD3/16+56CD19-PC5Flow-

4、Count荧光微球2：全血溶血试剂（Q-Prep）液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(Opt订yse C 液体室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球 液体10ML2-8GC （Flow-Check）仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100ul抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER QPRE

5、P制备系统开机一-显示READY灯亮一-选择35SEC灯亮一-开门-一放入试管 关门一-自动进行溶血-一显示READY灯亮-一开门-一取出试管 -一再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6）需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count （务必做 到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count, 而且加完即上机）报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV2%参考值（百分数（绝对值）CD3+CD4+ CD8+NK（175-567）Th/Ts临床意义、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状

6、态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染, 自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床 诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿 性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝 和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2： NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和 防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、 病

7、毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK 细胞增加。出淞(protocol)1榛邻舞I7W8BSC?5if e匸二“ r o -r I-占八:.4，: p(g|i 1 X RSLP; K|动 dtfS Y | Ddeaai Cawxnjatn |F55-(1(Og仏昶riiaaoA(Qx/x)n oxfeG&e*|U3&zJr SeupWr QiKUONPr “43*盯血Q5/如 WV* DuTJTMn 创徒 EGJSrF100SS卯rncc*rfCfFFCOF心xr*1KaFBmmWbx I

8、USF$FUFU点击-TTrFi4$c4 何何5|3SLnzJOamrmaF5Lri Lr AFC Loa PE LoaPCS Log FRRN到匚,PJprr)xhn甲 G*4 UOFiwkttOJb lOTvwtj(号 Z95HV申 save)2. a结果|F1A)2 Cdc CO3 CCM LMD FL LOOI炉12SOTCO3 GM IMO FL1 IOGF121D62 CSS|F 1 (4| 2 Color CD3 COl9tr4D FIH LOGfL2 IOG此图为CD45圈门如果做绝对计数，则tPn 邓)032 ADCQ Q以 口 v.-t _F 匸ill i ：1 |3丄 :

9、ndfrwPe：e.| x |gd i h吕c?迈.引农g*亠对rfa Edt 皿iMft Tc4i Pfau : AmM rt=e4A(Z f WrS *ytcvetv tlWuiyusik 产KbKOI WO Z如S5如P ZcMjrPRO 3ct*3rP5S5-chP 3ctlxSY5出 dJ cc*FS-SSlJ afcrSSHP 血MN飾“比 ACCF2tFUHT( ACcrztri2Ftr ArcrztrhM-5*.ACCFZYw/y.jr, 心 F3t3SsttH 心:FHRgPRDTOCOL1PRO Pl=4lGaiLMDFi.iQ0 ICO选中cell/ul即可活化淋巴细胞亚

10、群、记忆T及纯真T的测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter, 贝克曼库尔特)原理：双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白 细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞 仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数。活化淋巴细胞表面抗原为 CD3+/CD25+和 CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+ 是记忆型 T 细胞。CD3+/CD45RA+ 是纯真型T细胞。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量lmlo2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶

11、血的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X109/Lt样本需要稀释，用PBS稀释；若X107L,应分离单个核细胞。试剂剂型 规格 贮存贝克曼库尔特成分1:单克隆抗体液体28 C(CD3/HLA-DR CD3-FITCCD25-PC5CD45RA-PECD45R0-PE2：全血溶血试剂(Q-Prep) A：甲酸 B：碳酸钠等 C：多聚甲醛(Optilyse C 液体3:鞘液 液体 4：清洗液液体 5：荧光微球液体CD4-PC5) 液体20L5L10ML体体体液液液室温室温室温2-8C (Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制

12、备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100ul抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER QPREP制备系统开机一-显示READY灯亮一-选择35SEC灯亮一-开门-一放入试管 关门一-自动进行溶血-一显示READY灯亮-一开门-一取出试管 -一再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数操作性能精密度 批内五次重复CV5-10%提示排斥、 持续增加提示应作

13、病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它 们之间比例失调就会引起免疫功能亲乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身 免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。 CD45RA. CD45R0均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少； CD45R0+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢 性感染疾病中减少。方案（Protocol） 同淋巴细胞亚群检测结果（Result）仪器BeckmanC

14、oulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 （IgG2a-FITC/ IgGl-PE）2）分别向试管中加入混匀的100ul抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER QPREP制备系统开机一-显示READY灯亮一-选择35SEC灯亮-一开门一-放入试管 关门一-自动进行溶血一-显示READY灯亮-一开门-一取出试管 -一再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5）洗、离心、上机测样（备注：测B2

15、7 定要至少洗一遍方可上机检测） 报告结果报告阴阳性操作性能精密度 批内五次重复CV90%。HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB, 占人体整个基因的1/3000, HLA-B27是HLA-1类基因中B位点上的一个等位基 因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于I型 MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，人们发 现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱 炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直 性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临

16、床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病 的诊断中具有重要意义,HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重 要指标。方案（Protocol）1选参数3 u I；FFOIOOXIPTOL他 ftegn.sLyomc2 LQM心厂Setup M曲 r 26F 厂鼬沁wQ*SUhiII g J 怙cif H 6S IP . p - - Ia . ：1 H- L I r 8 3 2T% ICOcfT总霁 E2 sg * | 叶eg expels*! AxmPm Inh 2 如 l)|k6g$wcdN 创1191Z2Axqj 溥 s rofc 3ZJ片e“12JW0 IGXW.0 2*rFS

17、S5“P2 ecto PM 3cc*xF5$-.HPJ c血乃畑2 4 *r FSS 沁仃 iccto 35XP 心 FNRetW 心 LZtrui 鬥K A1cM*r AAu二15JZJQ 2 .4- f V： “ M I 41 II X |i三j(必3 2 S3 Q HJ 创刃&*trrwuirp瓦焉ioomris-15JXJ口 lAdi： I 1 F a j -r O J r.-工圧旺I Il x lie*2dI画2 0X|包蚣力0 _j *Q 33 | DrtKicw | Grrcctwian doion 他|1(Cw5wxfBtI1317.Z*O“5r SeG氏dr却站* r oco

18、mp r rxwqu：&S5s02如.用0 SctofFS-SSM.roO R3Nm-r.yor |F$Lr OewMa sTuTT7mFM (WIMDJXcT 如 nd?FSLh 的5 FITS PgH*|rl ( MKC 勻心:FN3SyM 封 AX F ?R.t (HT0S1QSO 回心:FNfU(P6)5nfroIRwtfCtcrer$MJ-5ftt jnng Oto lCOe*t5IxpeXTADCRb C Z IME Tec*? CC 20/ 口血边如H*saa 、二一声 s.i ts 員 y o | 厂键入文件名，点击Save2画图:et.nen 哄un I I - 律o时N H

19、i ICO结果L positive (+)(FTlKjyp 1B7 IMD - 5 5fl=SIF1IVM 慚丄MO FL1 LOG1023(F1(A| 187 LMD FL2L0018? LMD FL1 LOGUFL2 LOGB?B2?X-Mean=2. negative (-)(F1|A| 136丄 MD: FL1 LO&fFLZLOG|F1|A134.LMD : FL1 LOG/FL2 LOGX-Mean=X-Mean=CD55/CD59 测定方法流式细胞仪（BeckmanCouIter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59 分子的

20、表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞 （红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆 抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量lmlo2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3. 溶血样本不能用。试剂品牌贝克曼库尔特剂型成分1:单克隆抗体 液体(CD59-FITC CD55-PE2：全血溶血试剂A：甲酸B：碳酸钠等C：多聚甲醛3:鞘液4：清洗液5：荧光微球规格 贮存1ML28 CL L L

21、fn fn n13 IA 1A 0 2 47 3 1质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内保 持稳定，稀释的试剂于2-81可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准。仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：（一）白细胞CD55 /CD59检测1. 准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品lOOuU2. 溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER QPREP制备系统开机一-显示READY灯亮-一选择35SEC灯亮-开门-一放入试管 关门一-自动进行溶血一-

22、显示READY灯亮一-开门一-取出试管 -一再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3. 离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ulo避光20-30分钟。4. 洗涤离心5. 上机测样（二）红细胞CD55 / CD59检测1. 准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2. 分别加入CD55 / CD59 10ul和相应的同型对照lOulo3. 向二管中加入1: 200稀释的样品lOOul （可根据红细胞的数量调整），避 光20-30分钟。4. 洗涤离心。5. 混匀、上机测样。报告结果报告百分数操作性能精密度 批内五次重复CV97%CD5997%PNH

23、 的临界值：RBC CD5995%WBC CD5990%PNH的诊断值：RBC CD5991%大部分80%中性粒细胞CD5984%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。(Protocol)(同 HLA-B27)CH su.3$UnCO5$FITCd FM logJFL? Lc9庐 声 i 供1111Wass=n)2-D3M I II I I t t 11 *1 I I Icws-peCDWFITC结果:normal山卩2拆g RP8c55.LKD . PVT1 UriFS Uncflsu.1023$3 Lin06IO1io107C(W9(F1|E1

24、 RPBcd5599 LMD PwW Log(F1|E| RFBcd5599.LMD PMT2 Lo.pMT3 leg97.saw0*COM103 10*CD33:abnormalIbgS MTIUnre Log=FUnsH PMT3log1010*10*FfTC L0CD5S-干细胞检测和绝对计数方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干细胞 膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上 进行分析，从而得到百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备

25、检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求 1.样本量lmlo2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X107L,应分离单个核细胞。试剂品牌 贝克曼库尔特成分1:单克隆抗体（CD34 No. IM1871剂型 规格液体CD45-PC5 1M2652贮存28 CA：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(Optilyse C 液体室温Flow-Count荧光微球2：全血溶血试剂（Q-Prep）液体液洗光鞘清荧3 4 5体体体液液液2

26、0L室温5L室温10ML2-8C (Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 U1单克隆抗体和同型对照2）分别向试管中加入混匀的100ul抗凝血。3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟4）溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER QPREP制备系统开机一-显示READY灯亮一-选择35SEC灯亮一-开门-一放入试管 关门一-自动进行溶血-一显示READY灯亮-一开门-一取出试管 -一再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5

27、）需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count （务必做到三 同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count,而且加完即上机）6）上机测样报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度 批内五次重复CV2%参考值（百分数（绝对值）CD34+/CD45+%临床意义目前把CD34作为造血干细胞的主要标志，CD34阳性细胞计数作为造血干 细胞水平定量的检测方法。方案（Protocol） 同淋巴细胞亚群检测结果（Result）PMT1 lirUFS Lin102?ELCD34S5 Lin白血病免疫分型测定方法流式细胞仪（BeckmanCoulter, 贝克曼库尔特）原理：双色直接免疫

28、荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与细胞膜 上或膜内相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞 仪上进行分析，从而得到百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位骨髓采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝要求 1.样本量lmlo2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X109/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X109/L,应分离单个核细胞。试剂品牌贝克曼库尔特剂型 规格 贮存28 CIM2652A：甲酸B：碳酸钠等C：多聚甲醛(Optilyse C 液体3:鞘液液体20L4:清洗液液体5L5：

29、荧光微球液体1OML成分1:单克隆抗体液体（CD34 No. IM1871CD45-PC5Flow-Count荧光微球2：全血溶血试剂（Q-Prep）体体体体 液液液液7 3室温 室温 室温2-8C (Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作-样本制备：细胞膜表面抗原1. 首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2. 首先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3. 然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul（注意：必须是FITC和PE标 记的抗体搭配）4. 各管中加入标本（骨髄或外周血）30100ul（根据细胞的多少决定），振

30、荡混匀，室温避光2030分钟。5. 溶血：a. OptiLyse C（按说明书步骤溶血）b.使用COULTER QPREP制备系统开机一-显示READY灯亮-一选择35SEC灯亮一-开门-一放入试管 关门一-自动进行溶血一-显示READY灯亮一-开门-一取出试管 -一再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1. 准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2. 首先每管中加入标本（骨髓或外周血）100ul（根据细胞的多少决定）， 5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3. 每管中加入固定液100ul,剧烈振荡混匀，室温避光15

31、分钟。4. 各管中加入PBS4ml o5. 300g离心5分钟后，弃去上清液,振荡混匀。（1500r/min*5min）6. 各管中加入透膜剂lOOul,轻轻混匀，室温避光5分钟。7. 加抗体，阴性对照管中加入10ul,其余各管加入相应抗体各10ul,室温避光15分钟。8. 各管中加入4mlPBS,振荡混匀。9. 300g离心5分钟后，弃去上清液。10. 各管中加入PBS500ul,振荡混匀。11. 上机测样报告结果（报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV2%参考值CD34+5%MP0+5%粒系20%淋系30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案（Protocol）T细胞亚群细胞内因子IF

32、N- Y /IL-4检测方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA, Ionomycin和Monensin存在丁短期 培养（辅助性T细胞通过细胞因子IFN-y. IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚 群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺 激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻 止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量），然后进行 细胞膜表面抗原和细胞內细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞內的 IFN-Y和IL-4进行测定。标本采集

33、与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂肝素抗凝血要求 1.样本量至少lmk2. 样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3. 样本白细胞计数应在之间。若X1（T/L,样本需要稀释，用PBS稀释；若X109/L,应分离单个核 细 胞。4. 溶血样本不能用。试剂淋巴细胞培养体系(自配)成分：剌激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。单克隆抗体(BeckmanCoulter公司)CD4-PC5. IL-4-PE. IFN-Y -FITC。质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8C保存，可在有效期内保 持

34、稳定，稀释的试剂于2-81可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情 况随时进行校准。仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：细胞培养与染色取200ul抗凝血加入10ul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMI1640 洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5 % CO, 37工孵育18小时，取出后以PBS 洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一 为测定管加入10ul抗人IL-4-PE和IFN-Y-FITC,另一管加入同型对照，室温 避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定打开流式细胞仪及氫激光光源(488nm)预热

35、20min,同时仪器自动初始化； 用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以 上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然 后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-Y-FITC的表达。淋巴细胞在FS / SSC散点图中位置，即A门内细胞；A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； B门内TH细胞亚群分布：1区数值-一Th 1细胞(%)4区数值一-Th 2细胞(%)2区数值一-ThO细胞 (%)报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV2%正常参考值Thl(IFN-Y)： %Th2(IL-4)： %ThO : %临床意义淋巴细胞

36、均分泌多种细胞因子:Thl细胞主要分泌IL-2,IL-12,IFN-v和TNF-b /a等，Th2细胞主要分泌IL-4. IL-5. IL-6, IFM-Y为Thl最特异分泌的细 胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来 区分Thl与Th20 Thl为IFN-Y+, Th2为IL-4+。静息状态（人的正常生理状 态、即未受到任何刺激下ThO分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅 含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞內的IFN-Y和IL-4 也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中ThO 即会向Thl或Th2大量分化

37、，此时我们检测到的IFN-y和IL-4也较多。本实 验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。方案(Protocol)纟乡 liaFS UnOTFia logeoA0B01(K31 1 11 1 1 11 I 1 1 1 1 1 11 io1w*to1iceSS UnCDO心(ARND 司 FLZLoRFU Log一匕工石一IL9PE10?细胞周期分析方法流式细胞仪（BeckmanCoulter,贝克曼库尔特）原理：利用特殊的荧光染料（PI、EB、A0等）与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染 色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪 通过测定细胞的荧光强

38、度推算出细胞的DMA含量标本采集与处理检测对象 实体（肿瘤）组织、灌洗液、石蜡块、培养细胞 要求 1.实体（肿瘤）组织、灌洗液和培养细胞如果不能立即做应用 冷乙醇固定，一2（TC可保存2-3个月，一7CTC可保存半年以 上。2.样本计数应在x 107ml试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1： DNA-Prep试剂系统液体28C()(包括 DNA-Prep LPR 和DNA-Prep 染料） 室温 室温2：鞘液3：清洗液液体 液体20L5L4：荧光微球液体10ML2-8C (Flow-Check)仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra样本制备：灌洗液或培养细

39、胞1. PBS洗，稀释为X 107ml,取lOOul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep染料1ml,室温避光15分钟。2. 过300目滤网，上机检测。实体（肿瘤）组织1. 单细胞悬液制备：将固定或新鲜的组织放在120目不锈钢网上，下置一平 皿，用眼科剪刀将组织剪碎，用眼科辍子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐 水冲洗，直至将组织搓完为止。（如果是淋巴瘤只需用生理盐水冲即可）。 将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以500 800转离心沉淀2分钟。2. 染色：同上3.,上机检测石蜡块1. 脱蜡水化：石蜡块切成50um厚，3-5片，放入二甲苯中室温放置

40、24小时, 更换二甲苯室温再置24小时。取出加无水乙醇10分钟，依次加95%乙醇、 70%乙醇、50%乙醇及双蒸水各10分钟。2. 单细胞悬液制备及染色：同上3. 上机检测报告结果报告各期的百分数操作性能精密度批内五次重复CV 詔H|jiII丨 |3 Lillig III會切I Xl和卿闻Qm moi c 叶Z|Uri I C*3*:0g CcnwMn |zJ厂 $4*PCd* r QWWZBF r 9 ”?x?Q 伽 冲|woEaanxe;JcfF常常cfFaacoslr f$snrpe&:兀AuPomet SectionLn Leg PoN p rp r：r rF$SSR.1DaXdPi旳

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