植物CRISPR-Cas9基因组编辑系统与突变分析汇总

1、综述逐世hereditas (beijing) 2016 年 2 月,38(2): 118125植物crispr/cas9基因组编辑系统与突变分析马兴亮1,2,刘耀光1,2510642 ;1 .亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广州2 .华南农业大学生命科学学院，广州 510642摘要：基因组定点编辑技术通过可编码核酸酶切割基因组特定位点，进而诱导基因组定点突变。crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein

2、9)基因组编辑系统由cas9 核酸酶以及 sgrna(single guide rna) 组成，与其他可编码核酸酶系统如锌指核酸酶(zinc finger nucleases, zfns)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, talens)相比具有更简便的操作性和更高的基因组定点编辑效率。目前在植物中已有多例应用crispr/cas9系统进行基因组编辑的报道。本文从cas9基因与sgrna表达载体的构建策略，获得基因组定点编辑突变体的转化方法、突变的效率和特征、 突变的检测方法等方面进行了总结，最后对植物

3、中利用crispr/cas9系统进行基因组编辑存在的问题以及发展前景进行了讨论。关键词：植物；crispr/cas9 ;靶向突变；基因型鉴定crispr/cas9-based genome editing systems and the analysis of targeted genome mutations in plantsxingliang ma 1,2, yaoguang liu1,21. state key laboratory for conservation and utilization of subtropical agro-bioresources, guangzhou

4、510642, china;2. college of life sciences, south china agricultural university, guangzhou 510642, chinaabstract:targeted genomic editing technologies use programmable dna nucleases to cleave genomic target sites,thus inducing targeted mutations in the genomes. the newly prevailed clustered regularly

5、 interspaced short palindromic repeats/crispr-associated protein 9 (crispr/cas9) system that consists of the cas9 nuclease and single guide rna (sgrna) has the advantages of simplicity and high efficiency as compared to other programmable dna nuclease systems such as zinc finger nucleases (zfns) and

6、 transcription activator like effector nucleases (talens).currently, a number of cases have been reported on the application of the crispr/cas9 genomic editing technologyin plants. in this review, we summarize the strategies for preparing the cas9 and sgrna expression constructs, the transformation

7、method for obtaining targeted mutations, the efficiency and features of the resulting mutations and the methods for detecting or genotyping of the mutation sites. we also discuss the existing problems and perspectives of收稿日期：2015- 09- 15;修回日期：2015- 12-03基金项目：转基因植物研究与产业化专项(编号：2014zx08010-001, 2014zx0

8、8009-002)资助supported by the transgenic research program(nos.2014zx08010-001,2014zx08009-002); ministry of agriculture of the people s republic of china作者简介：马兴亮，博士研究生，研究方向：生物化学g分子生而学。e-mail: 通讯作者：刘耀光，博士，研究员，博士生导师，研究方向：植物遗传学与分子生物学。e-mail: doi: 10.16288/j.yczz.15-395网

9、络出版时间：2015/12/30 17:12:49url: http:/kcms/detail/11.1913.r.20151230.1712.005.html第2期马兴亮等：植物crispr心as9基因组编辑系统与突变分析119crispr/cas9-based genomic editing in plants.keywords:plants; crispr/cas9; targeted mutations; genotyping在生命科学领域，突变体对于基因功能研究具 有至关重要的作用。传统的随机诱变方法往往需要 构建大群体的突变体库，并进行大规模筛选才能获 得目

10、的基因丧失功能的突变体。这一过程需要大量 的人力与物力1,2。与之相比，直接在基因组特定位 置引入突变的方法，即基因组定点编辑技术无疑具 有巨大优势。新近发展的序列特异性核酸酶(sequence specific nuclease, ssn),如锌指核酸酶 (zinc finger nucleases, zfns)、类转录激活因子效应物核酸酶 (transcription activator like effector nucleases, talens) 和 crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repea

11、ts/crispr-associated protein 9), 通过在生物体基因组特定位置引入染色体双链断裂(double strand break, dsb)进而引发生物体内源的 非同源末端连接 (non-homologous end joining, nhej) 修复。易错的 nhej修复往往导致修复位点产生小 片段dna的插入或者缺失，如果插入或者缺失发生 在基因的编码区，就会造成目的基因的移码突变37与突变体库筛选相比较，基因组定点编辑技术针对 性强，省去了后续的大规模群体筛选工作，能极大 提高获得目的基因突变体的效率 网。序列特异性核 酸酶中的zfns与talens都是融合dna识

12、别结构 域(锌指或者tal效应子)与核酸酶结构域而形成的 嵌合蛋白，一般需要二聚 化才能发挥作用。组装 zfns与talens的dna识别结构域的表达单元都 相对复杂，而且重复性较差。而 crispr/ cas9系统 由 sgrna(single guide rna) 与 cas9 蛋白两个元件 组成。sgrna 5 端的20个碱基通过碱基互补配对 的方式决定靶序列，cas9蛋白负责切割靶序列6,7,因而构建表达单元十分简便。应用crispr/ cas9对动植物进行基因组编辑的报道大大超过了zfns与talens , crispr心as9成为基因组编辑技术的一个 新突破9 o在植物中已经有多篇

13、关于crispr心as9系统的验证以及应用的报道1017 o本文总结了植物crispr心as9表达载体系统及其应用、基因编辑突变的检测与分析方法，并展望了crispr /cas9系统在植物中的发展前景。1 植物crispr/cas9基因组编辑载体系统cas9基因来源于化脓性链球菌n型crispr获得性免疫系统，编码区全长 4107 bp 6。cas9基因应用于真核生物基因组编辑还需要添加核定位信号， 以保证cas9蛋白能定位到细胞核7,18 o用于植物基因组编辑的cas9基因一般都进行了植物密码子的优化7,10,17,但也有将动物密码子优化的cas9基因序列直接应用于植物的报道12,13 o有

14、证据表明，密码子优化可以提高cas9基因的表达水平11,19 o 一般采用转录活性高的组成型启动子驱动cas9基因，如泛素 ubi启 动子、花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)camv35s(p35s) 启动子1014,16,17。然而, 如果利用常用的农杆菌滴(浸)花蕾法转化拟南芥 (arabidopsis thaliana ),利用 p35s 驱动 cas9 基因的 突变效率较低且ti代转化体往往产生嵌合突变17 o而利用器官特异启动子驱动cas9 ,如雌配子体特异启动子20、雄配子体特异启动子21、分生组织启动子22、以及在胚、胚囊、胚乳和花粉中高表达的ya

15、o基因启动子23,可以提高拟南芥基因组突变的效率， 并增加遗传效率。决定靶点特异性的sgrna为一段具有特定二级结构的小 rna ,通常需采用由m型rna聚合酶转录、有固定转录起始碱基的u3/u6系列启动子驱动1013,17。gao等16将sgrna两端锚定能自我剪切 的核酶，从而可利用常规启动子转录sgrna的体外和体内生成，从而可调节 sgrna在植物中的时空特 异表达。通过植物基因组编辑获得可遗传的突变才具有 实用价值。通常的策略是采用农杆菌转化或基因枪 转化方法将 cas9基因和sgrna表达盒导入整合到 植物基因组中获得稳定转化体，表达出cas9蛋白和sgrna发挥基因组编辑作用(表

16、1)。但是，其他的策略如cas9和sgrna表达盒不整合进染色体的瞬时 转化也可以在体内产生cas9蛋白和sgrna,产生基12。眄盘 hered一fas (be=-ng) 2016植物种类gup密码子优化参照。5学启动子sgrna战动子载体靶 点数转化方法上如织突变效率（也突变事件/检刑 总事件）.主要突变类型参考文献水稻水稻2jcp35sosu31范因枪/愈伤8.2%(16/194)双等也纯合+杂合【期水稻人posubi（水稻来源）osu32农杆菌/愈材45.3%(225/491)烟等位,杂合.纯合，低合31水稻水稻posubiosu6d,osu6,24农杆前/愈伤67.9%(9/25)纯

17、合，杂合，双等位l32水稻植物2i(p35satu6-261农杆菌/愈饬&.6%印j水稻水稻pemubi（玉米来源）osu3d osu6a, osu6bhosu也农杆菌愈伤&5.4%(2fio/32&)双等位,纯合，杂合拟南芥人paiubi （技南芥来源）atu62农杆菌嘴蕾8 l2阳1234m高逋量测序）嵌合口3,34拟南芥拟南芥ppcubi (欧芹 peirosehnum cria- 目画)来源atu6-261农杆菌赧蕾加：7%（高通量测序）嵌合四披南芥玉米p3先atu6-26n acu6-292农杆曲喷雷s3.6%展合网撅南芥apicum拟南芥来源.分生组织中 高表达）atu64农杆菌班

18、蕾20.6% （出现突变表型比例）嵌合附援南芥水相2kp355attbb, atubd, atu64baiu6-29衣杆菌能营监6阳4却叫就等位,纯台下杂合f嵌合lhj拟南芥拟南芥peci.2（fi喃芥来源，卵子特异表达）atu6-26a aiu6-292b衣杆菌碓蕾荻等位,纯合*杂合f嵌合冽拟南芥人pyao（指南芥来源，胚等高表达）afu6-261农杆菌，潴曹&8.5%-90.5%嵌合23烟草烟草2p35saiu6-262农杆前/叶盘375% (23/27)嵌合网四红柿ap35satu62农杆菌/子叶双等位.鲤合，嵌合36jt米玉米pzmljbiosu3riku32b农杆菌沫成熟睡60% （

19、靶点同时突变出现我 型比例）双等位.纯合刈工米玉米pzmubizmu63基因枪/未成熟胚77%-100%双等位.杂合冽小麦植物pzinubitau6小麦）1基因枪/未成熟股5.6%(4/72)纯合土豆水稻2p35sstu6 (s)1农杆菌感段83.3%(5/6)37穗树水稻p35satu3h atu3d, aiu6-1, atu6-294b农杆前/叶盘50.9%(30/59)双枇纯合，杂合，嵌合17,38表1植物稳定转化crtspr/casq载体系统及基因修饰效率和特征table 1 plant crispr/cas9 vector for stable genetic iransformat

20、lon and the mutagon features注：“由于计算方法不同（如用高通址测序低合突变体.只要检测到有细胞发生突变就算是突变体），各报道的突变效率之间不一定有可比性;卜采用gwdfiilg血酶切连接方法构建转化表达载体，其余报道采用传统的福切连搂方法,m38 咪第2期马兴亮等：植物crispr心as9基因组编辑系统与突变分析125因组编辑效果。 例如，通过病毒载体瞬时转化植物， 或者将纯化的序列特异性核酸酶导入植物细胞，也 可能产生基因组定点修饰24,25。svitashev等囤通过基因枪方法将体外转录的sgrna直接导入已转化整合cas9表达盒的玉米（zea mays ）未成

21、熟胚，成功获 得了基因组编辑。多靶点同时编辑在基础研究和应用方面都具有重要的价值。目前大部分植物 crispr/cas9载体系 统采用常规的酶切连接克隆方法构建 cas9/sgrna 表达载体，只适合同时打靶单个或少数几个靶点。ma等17构建了一套适用于单子叶和双子叶植物并 可进行多靶点修饰的pylcrispr心as9 载体系统。该载体系统利用pcr扩增获得多个含不同靶序列的sgrna表达盒，并通过基于n s型限制性内切酶（如 bsa i ）的golden gate ligation 27或者基于复合酶的 gibson assembly 28克隆技术，一次性整合到 crispr/ cas9双元

22、载体上。另一个植物 crispr/cas9载体系 统也是利用 golden gate克隆方法将几个sgrna表达盒组装到crispr/cas9 双元载体29。其余的 crispr/cas9载体系统使用传统的n型限制性内切 酶克隆方法，需要多轮克隆将少数几个sgrna表达盒组装到 crispr/cas9双元载体（表1）。此外，利用 核酸酶剪接或多顺反子trna前体序列剪接也可以在植物体内产生多个靶点sgrna 16,30。这些多靶点载体系统通过一次转化在受体细胞表达多种sgrna ,可以同时对多基因多性状进行修饰。例如，ma等17将含有8个靶点sgrna表达盒的载体转化水稻 （oryza sat

23、iva ）,成功敲除了一个基因家族的7个成员。2 植物crispr/cas9系统产生的突变效率、 类型和变异特征目前，利用 crispr/cas9系统已成功对多个植 物物种进行了基因组编辑，并获得了稳定遗传的突 变体（表1）。然而，针对相同的物种利用不同的载体 系统的突变效率差异非常大，同一个载体系统针对 不同的植物获得的突变形式与效率也不尽相同（表1）。cas9基因的密码子优化、cas9基因选用的启动子与终止子、农杆菌侵染过程中 t-dna插入基因组 的位点都会影响cas9的表达水平和活性，进而影响打靶效果17,20,21 o基因组编辑突变效率还与靶位点本身的序列组成如 gc含量、靶点序列与

24、 sgrna可 能的二级结构有关化39。在水稻中，gc含量高于40% 的靶点比gc含量较低的靶点有较高的突变效率17 o通常按以下规则选择基因组靶点序列：5 /-an19n-gg-3使用 u3 启动子，ngg : protospacer adjacent motif, pam） 或 5/-gn19ngg-3 / （使用 u6 启动子）。但最近研究发现，非规则的5（t/c）n19ngg-3 /靶点 （任意使用u3或u6启动子）也具有等同的突变效率， 该发现扩大了选择靶点的自由度17 o另外，基因组编辑突变效率也可能与不同植物以及同种植物的不 同组织中细胞的nhej修复能力有关；如果修复能力高，即

25、使靶点序列产生了dsb也可能被正确修复而不产生突变。用crispr/cas9系统修饰水稻基因组，在转化体当代（转化愈伤组织获得的t0植株）的突变大部分为简单的双等位突变（指2条同源条染色体的相同 靶点都独立发生了不同的突变事件卜纯合突变（指2条同源染色体的相同靶点发生了相同的突变事件）、或者杂合突变（指2条同源染色体的相同靶点只有一 个发生了突变），少部分为嵌合突变（指一个植株的不同细胞分别独立发生多种不同的突变事件）17,40。然而，在拟南芥转化第1代（转化花蕾获得的ti植株）中一般为嵌合突变（表1）,也有产生双等位突变、纯合突变或杂合突变17,20,23,34 o对水稻 ti代与拟南芥 t

26、2代分析表明基因组定点编辑获得的突变是可遗传 的 17,20,30,31,32值得关注的是，在水稻中产生的t0代基因编辑突变体中，有相当高的比例为纯合突变17,31。ma等17推算认为，在占总突变27.8%的纯合突变中，约11.7% 是由2个相同的独立突变产生，其余16.1%的纯合突变是先在一条染色体位点产生非同源末端连接（nhej）的突变，然后以此为模板在另一染色体位点 进行同源重组（hdr）引入相同突变的方式产生的。这种纯合突变的 nhej-hdr模型在动物的基因组编 辑也有报道41,42 ocrispr/cas9 导致的突变是以 cas9蛋白在pam上游第3碱基处的切割位点为中心6。其中

27、，超过一半的突变为单碱基插入，其中又以a或t插入为主17,31 o大部分删除突变为单碱基到几十碱基的删除，但删除碱基的数目越多，其出现的频率越 低17 o出现碱基替换突变的频率很低17,31,34。如果在一个染色体小区域设计2个或多个靶点，还可能产生靶点之间的大片段缺失13,17,30,32,因此可以实现对整个基因或较大染色体区段的删除。3 crispr/cas9系统在植物性状改良和基 因功能研究的应用由于在基因编码区产生的大部分突变会产生移 码或片段缺失，可导致靶标基因的功能缺失，产生 性状变异。例如，wang等15敲除了六倍体面包小麦 (triticum aestivum )a1基因组上的

28、 tamlo 白粉病易 感基因。liang等43敲除了玉米植酸 (phytic acid,pa) 17. 合成通路中的zmipk (ay172635)基因。ma等 将粳稻品种台中 65 (含14.6%直链淀粉)的waxy基因进 行了打靶突变，产生了直链淀粉含量为2.6%的糯性品系。fan等38和刘婷婷等44对杨树(populus to- mentosa)的pds基因进行多靶点修饰，在 t。代转化 体获得了白化突变体。由于木本植物的生殖周期长，在t。转化体就能够获得目标基因的突变表型尤其重 要。最近，ji等45利用crispr/cas9系统获得了对 甜菜曲顶病毒 (beet severe cur

29、ly top virus, bsctv) 具 有抗性的拟南芥与烟草(nicotiana tobacum)突变体，且此抗性可以稳定遗传到后代。另外，以 crispr/ cas9基因组编辑技术正广泛应用于植物新基因的功 能研究17，比反义基因和 rna干扰(rnai)技术的 效果更好。因此， crispr/cas9基因组编辑技术将 广泛用于植物基础生物学研究和作物遗传改良应用。4基因组修饰突变的检测方法根据crispr/cas9在细胞系或个体中产生突变 的频率和特征，可以采用相应的方法检测目标靶点 的突变情况。利用dna 酶分析鉴定突变。pcr/re (pcr/res-triction enzym

30、e) 检测法将靶点切割位点设计在限制 性内切酶识别位点上，crispr/cas9诱导的突变同时也改变了该酶切位点，被突变的靶序列不能被限 制性内切酶切断，从而可以通过对酶切基因组dna进行pcr扩增富集10。但由于要在切点存在限制性 内切酶位点才适合作为靶点，pcr/re方法限制了编辑靶点的选择。t7e1和surveyor分析方法是将 crispr/cas9打靶样品与野生型对照样品包含靶序 列的pcr产物混合变性后复性，突变分子与野生型 分子结合产生错配，再利用特异切割错配分子的t7内切酶1或者surveyor 酶处理，利用处理产物 的电泳图谱来推测突变的存在情况46,47 o gao等16利

31、用体外转录出的sgrna与cas9蛋白组合，直接检验设计的靶位点突变效果以及突变。利用高分辨率溶解曲线(high resolution melting, hrm) 分析方法 也可以用于筛选鉴定crispr/cas9打靶产生的突变体14。以上方法都只能检测是否存在突变，不能确 定具体的碱基变异序列。通过高通量测序方法也可以检测crispr/cas9诱导的目标突变以及分析可能的脱靶突变。此方法 首先对每个打靶转化体dna建测序库，各自连接标记接头。如果靶点不多，可用嵌合引物(前端与目标序列配对，后端是测序/标签序列)扩增包含各靶点的 特异片段建测序文库。然后将各样品混合，进行高 通量测序；将测序结

32、果与野生型参考序列比对，找 出突变序列。高通量测序可以同时分析多个株系和 多个靶点，但构建测序文库和测序的费用较高，需 要时间较长，主要适用于检测嵌合突变和低频度突 变为主的材料14, 48 o以上方法主要是 talens和crispr/cas9系统 发展早期被用于检验打靶的有效性，或用于检测复杂的嵌合和低频突变。然而，目前 crispr/cas9系 统在多种植物已获得了较高的突变率，在t0植株(或滴花法获得的拟南芥ti植株)及其后代就可以产生可遗传的简单模式的突变(双等位突变、纯合突变和 杂合突变)(表1)。对这些简单模式的突变，用特异 引物扩增出包含靶点的目标序列用于测序更为简便。但由于含

33、有双等位突变和杂合突变的pcr产物直接测序会产生重叠峰，通常的做法是将pcr产物克隆到质粒载体后，再对每个样品测定若干个克隆。如 果样品数目较多，这样的操作工作量大，成本也高。为了快速、高效鉴定这类简单模式的突变序列，ma等49开发了一种对pcr产物直接测序产生的重叠峰进行解码的简单有效的方法(degenerate sequencedecoding, dsd） 。dsd 方法紧密结合crispr 或talens诱导突变的特点，仅对产生双峰的起始位 置为中心的有限范围的碱基进行解析，可快速有效 地分解出2个等位变异序列或杂合突变序列。根据 dsd方法原理，liu等50进一步开发了开放在线软 件

34、dsdecode （/） ,只需把 包含野生型靶序列的参照序列和pcr产物直接测序文件（ab1格式文件）上载，就可对测序文件中的双等 位突变、杂合突变、和纯合突变进行快速的自动 解码。5结语与展望crispr心as9技术系统的出现，将大大改变反 向遗传学中获得突变体的方式和分子育种的策略。 然而，通过突变体库筛选突变体，并通过正向遗传 学手段克隆功能基因的策略仍将继续发挥作用。对 crispr/cas9系统的理论研究也取得重要进展，如 解析了 cas9与sgrna结合dna的晶体结构51 ,以 及对cas9蛋白的各种修饰相继被报道52, 53。

35、最近，美国麻省理工学院和哈佛学院的张峰博士实验室又 鉴定出2种与cas9蛋白具有相似功能、同样来源于 crispr系统的cpf1蛋白，形成了 crispr/cpf1系 统54。cpf1的pam特异性以及切割方式都不同于 cas9,这一发现无疑是对基于crispr基因组编辑技术的重要补充。crispr/cas9及其相关技术系统的发展将对植 物的基础研究与应用产生革命性的影响。然而，人 们也产生了对此技术可能被滥用的担忧9 o但与医学以及动物研究相比，植物基因组修饰涉及的基础 与应用研究不涉及伦理问题，植物中应用crispr/cas9系统具有更大的自由度。从生物学原理上讲， 基于crispr/ca

36、s9等的基因组编辑技术的基因定点 突变与传统的基因随机突变（自然突变或人工诱变）的性质具有实质等同性，但基因组编辑定点突变更 具有针对性和效率性。并且，通过后代的遗传分离 可以获得不含转基因元件的突变株系，因此基因组 编辑技术应当比传统的诱变育种方法具有更高的安 全性。目前基于crispr/cas9系统的植物基因组修饰主要是对特定位点的突变和2个靶点之间的片段缺失，一般产生目标基因的功能丧失。而对植物基因 组特定序列进行精确的替换、插入、和缺失操作， 并且产生可遗传植株的技术难题尚未完全解决。因 此，发展这种更高层次的基因组修饰技术无疑是今 后的努力方向。参考文献(references):1

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