一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的分离鉴定及其基因组和胞外蛋白组研究

1、一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的分离鉴定及其基因组和胞外 蛋白组研究 乳酸菌分泌的细菌素因其安全、无毒且有较强的抑菌活性 , 能被机体降解 , 不产生耐药性等优点 , 被普遍认为是抗生素的有效替代物。牦牛是青藏高原的特 有畜种,是当地牧民赖以生存的重要物资 , 但还未见到对牦牛胃肠道产细菌素乳 酸菌分离鉴定的相关报道。 本实验的目的是对牦牛肠道产细菌素乳酸菌进行分离鉴定 , 研究其生物学特 性并从分子水平上诠释其益生特性 , 为进一步开发牦牛专用的微生态制剂奠定基 础, 取得如下成果 :1 一株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的分离鉴定用含有0.5%碳 酸钙MRS固体培养基从19份牦牛粪便样本中分离出9

2、1株乳酸菌,采用牛津杯法 筛选产细菌素乳酸菌,并利用16S rRNA鉴定。结果表明：在排除有机酸、过氧化 氢等干扰因素后 ,从分离纯化到的 91 株乳酸菌中筛选到 9株对大肠杆菌 ATCC25922口金葡球菌ATCC2592仍有明显抑制作用的菌株,并且对蛋白酶敏感, 初步认定为产细菌素乳酸菌；经16SrRNA鉴定为4株海氏肠球菌、3株屎肠球菌、 1 株蒙氏肠球菌、 1 株植物乳杆菌。 鉴于植物乳杆菌抑菌效果最好并且是 饲料添加剂品种目录 和食品添加 剂品种目录中允许使用的菌种 ,所以选其为研究对象 ,命名为植物乳杆菌 SWUN5815进一步的研究表明：该菌株对临床分离的牦牛腹泻病原菌具有很强的

3、 广谱抑菌活性；此菌株在pH=2时存活率为58.2%,pH=3时存活率为86.9%,胆盐浓 度0.3%时存活率为66.8%,具有良好的耐酸耐胆盐能力；对Caco-2细胞粘附率为 42%；对常用的抗生素敏感 , 不具耐药性。 因此，该菌株是一株有潜力的候选益生菌株。2植物乳杆菌SWUN581株对小 鼠增重和肠黏膜免疫的作用 40只18 g 左右的雌性昆明小鼠分成 4组,每组10 只。 1-3组为实验组,每日分别灌服5X 106 CFU 5X 107 CFU 5X 108 CFU的植 物乳杆菌SWUN581连续灌胃21 d;4组为对照组,灌服相同体积的MRS肉汤作对 照。每 7 d 称重后每组随机

4、取 3 只实验组与 3 只对照组小鼠 , 刮取小肠黏膜加入 等体积的PBS缓冲液(pH=7.4)混匀，以6000X g离心力离心15 min,获得上清液 于-20 C保存，用双抗夹心法测定SlgA。 结果显示饲喂SWUN581的各剂量组小鼠平均增重均高于对照组小鼠，其中 灌胃5X 108CFU的剂量组增重效果极显著高于对照组(P0.01)。并且SIgA 极显著提高 (P0.01)。 因此，牦牛源植物乳杆菌SWUN581能够促进小鼠的生长发育，提高肠粘膜免 疫力，可以作为牦牛益生菌的候选菌株。3植物乳杆菌SWUN581株在小鼠体内拮 抗沙门菌的作用研究 20只18 g 左右的雌性昆明小鼠分成 2

5、组,实验组每天饲喂 5X 108 CFU SWUN581对照组饲喂同体积 MRS汤，连续1周后同时灌胃5X 106 CFU鼠伤寒沙门菌，分别于感染48 h、96 h解剖3只小鼠，取肺、脾、肝、十二 指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠 ,4%多聚甲醛固定后切片 ,H.E 染色, 观察组织病 理变化；同时以B -actin位内参，荧光定量PCR法检测十二指肠、空肠、回肠、 结肠、盲肠等组织样本中TNF-a、IFN- 丫、1L-1 B、1L-6四种炎性细胞因子的 变化。 结果表明：在感染48 h和96 h,实验组小鼠组织器官的病理变化程度明显轻 于对照组；感染后48 h,实验组与对照组相比TNF-a、IF

6、N- 丫、1L-1 B、1L-6四 种细胞因子受到显著抑制，感染96 h后,实验组与对照组相比差异降低。因此 SWUN581具有抑制炎性细胞因子表达,减轻沙门菌引起的肠道病理损伤的作用 4植物乳杆菌SWUN581株基因组和胞外蛋白组的研究为进一步从分子水平 解析其益生性能,采用3代基因测序技术得到SWUN581株高质量的基因组完成图 并通过质谱技术鉴定了该菌株的胞外蛋白成分。结果显示 ,该菌株基因组全长 3345067 bp,编码3258个基因;18个合成II类细菌素相关基因，因此具有广谱抑 菌活性；同时该菌株具有编码Atg22和DUF144C家族蛋白的基因簇，因此具有耐胆 盐和耐酸能力；该菌株具有编码Dps家族蛋白的基因簇，能促进宿主的先天性免 疫。 胞