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文档简介
1、感受态细胞制备实验目的1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术;2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法;3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。实验原理在基因克隆技术中,所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞, 表达相应的选择标记基因,并在一定的培养条件下,在选择性培养基上长 出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内,才能进行扩增和表 达,从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的 状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受 态,而另一些细菌只有处于某个生长时期 时,才会处于感受态,如大肠杆 菌。大肠杆菌的感受态细胞 制备原理是取对数生长期
2、的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的疑基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42 C短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时 后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表 达。对这种现象的一种解释是CaCI2能使细菌细胞壁的通透性增强,目前 还可以使用电激的方法,通过瞬间的高压电流,在细胞上形成孔洞,使外源DNA进入胞内,从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化 学法高出1到2个数量级,达到1x108转化子每1卩gDNA甚至 1x109转化子每1卩gDNA所以常用于文库构建时的转化或遗传
3、筛 选化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70 C保存,因此被广泛用于外源基因的转 化。物理制备法:电转法,除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需 要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌, 转化率最高能达到1091010转化子/卩g闭环DNA因操作简便, 愈来愈为人们所接受。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿 中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:转化总数二菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积/涂 板菌液体积转化率(转化子数/每卩g质粒DNA =转化子总数/质粒DNA加 入量(卩g)理论上转化率最高为每
4、微克地标准质粒转化的菌落数为們0 10实验仪器:恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥 形瓶、离心管、LB液体培养基、 实验试剂:溶液、含10%甘油的溶液、GYT三蒸水、10%甘油的水、实验材料溶液、DH5a TopIO、DE3 BL21、液氮、冰水。实验步骤(一)化学感受态细胞的制备(1) 菌种的活化:取-70 C的冰箱中感受态细胞DH5%、TopIO、DE3 BL21在LB的平板上进行划线分离。(2) 菌种的前培养:从LB平板上挑取相应的单菌落,接种于 10mlLB液体培养基中,37C振荡培养过夜至对数生长中后期。(3) 菌种的准备:将该四种菌悬液以1:100的比例分别接种于四
5、 个不含有抗生WOmlLB液体培养基锥形瓶中,37 C振荡培养大约小 时至OD= (4) 感受态细胞的制备: 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100mL培养液均匀 分成两份到50mL离心管中,在4C、3000转每分钟,离心 10min。 弃去上清液,加入的OaCb溶液,轻轻混匀,在冰水中静置30min。 弃去上清液,加入的CaCL溶液,用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充 分混匀,在冰水中静置30min。 从冰水中取出4C、3000转每分钟,离心10min,弃去上清液并 用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净,加入含10%甘油的溶液。用 巴氏管轻轻吸起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。 把液氮倒到小的塑
6、料盒子里,在离心管架子上摆放好离心管,用 剪过的移液枪头进行分装,每个离心管中分装40 Z悬浮液。 迅速盖好盖子放入到液氮中,使之迅速冷冻,然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中,-70 C保存。(二)电转化的感受态细胞的制备第1、2、3步同化学转化的感受态细胞的制备过程的1、2、3三 步相同。(4 )制备感受态细: 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把100mL培养液 均匀分成两份到50mL离心管中,在4C、3000转每分钟,离心 10min 弃去上清液,加入30mL三蒸水,用巴氏管吸起液体打到离 心管壁上使沉淀充分混匀,在4 C、3000转每分钟下离心10mi n, 倒去上清。重
7、复两次; 再加入30mL含10%甘油水溶液,在4C、3000转每 分钟下离心10mi n,重复一次。 弃去上清液,加入(含有10%Glysiron、%YeastExtraction、%Trypton),放置在冰 上。(5) 准备好成有液氮的塑料盒子和把离心管若干放到离心 管架子 上,将悬浮的感受态细胞分装在离心管中,每管40 u I,迅速盖好盖 子放入到液氮中,使之迅速冷冻,然后放在标有感受态细胞种类、制 作者和时间的袋中,-70 C保存。三)效价检测1、化学转化:(1) 取化学转化感受态细胞于冰上解冻,同时把标准 质粒 PUC19稀释十倍置于冰上。(2) 在含有40u I感受态细胞的离心管中
8、加入1u L稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min (3) 将离心管置于42 C干式恒温器上90s,然后迅速放回冰 上,使细胞冷却23min。(4) 向离心管中加入已预热的无菌LB培养液400卩L,再转移到10ml离心管中,37C恒温振荡培养4560min。(5) 将离心管内容物混匀,分别吸取卩L和110UL菌液于含有AMP勺LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细 胞均匀涂开,将平板置于室温下直到液体被吸收,倒置平板,在37 C过夜培养,然后通过菌落数计算效价。2、电转化:(1 )取电转化感受态细胞于冰上解冻,标准质粒也 置于冰上,同时准备干净的电击杯于冰上预冷。(2) 在含有40
9、卩I感受态细胞的离心管中加入1卩L稀释十倍的标准质粒,充分混匀。然后转移到电击杯中,把电击杯放 在电击仪上进行电击(2500V,5ms)。(3) 在电击杯中加入160卩L无菌LB培养液(无抗生素), 然后充分混匀,吸取于10ml离心管中,置于37C恒温振荡器中培 养 4560min.(4) 分别取2卩L和50卩L涂板,涂板操作同化学转化。(5) 平板放到37 C的恒温培养箱过夜培养。第二天早上读取 两个平板的菌落数。四、实验结果1、电转化感受态细胞的效价:涂2卩L菌液的平板上菌落数 为88个,通过计算知道,电转化感受态细胞的效价为x108o2、化学转化感受态细胞的效价:无菌落生成,同组的也没有
10、出 来结果。五、讨论1、感受态细胞制备及转化中的影响因素 细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4C的培养菌, 最好从一70C或-20 C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的 菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好,可通过监测培养液的 0D600来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的标准质粒即可使50卩I 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。 试剂的质量:所用的试剂,如CaCb等均需是最高纯度的,并用超 纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下迸行,所用器皿,如离心管,枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的 试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则 均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的 麻烦。 整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降 低。2
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