免检实验设计抗血清的制备

1、抗体的制备多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血(1)动物的选择选择什么动物来免疫取决于：*所需抗血清的量-小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。*能供免疫用的抗原量g足够，而山羊需要几毫克。m-小鼠50(1)动物的选择(续)*动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。(2)佐剂 (adjuvant)*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代

2、谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:-弗氏不完全佐剂(freunds incomplete adjuvant)-弗氏完全佐剂(freunds complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(freunds incomplete adjuvant, fia)*是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。弗氏完全佐剂 (freunds co

3、mplete adjuvant, fca)*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml)，即成为fca。*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。佐剂与抗原乳化的方法*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。*缺点：研钵壁上粘附

4、大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法(续)*注射器混合法-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。*缺点：不易乳化，时间长。佐剂与抗原乳化的方法(续)*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。-每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心510min收

5、集。*优点：简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。(3)免疫方法免疫途径*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。*一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。(3)免疫方法免疫途径 (续)*几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射g抗原即可获得较好的免疫效果。m-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。 (3

6、)免疫方法次数及间隔时间*次数一般为23次(初次免疫和加强免疫)-首次注射后，1015天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫 *初次免疫gm-用50200 ag加入fca，在背部皮下注射68点，每点0.10.2ml，也可肌肉内或皮内注射；*两周后，加强免疫gm-将50200 ag于pbs或fia中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩

7、散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔*一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；g；m-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为2550-末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。举例3：豚鼠和大鼠的免疫 *初次免疫g ag加入fca，在背部皮内注射46点，每点m-用10100 0.lml，也可肌肉内或

8、皮下注射；*加强免疫g ag于m-每隔 78天，将1050 pbs或fia中。在肌肉、皮下或静脉注射；*抗体效价的检测(4)免疫剂量*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。(4)免疫剂量 (续)*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量(5) 抗体效价的检测多采免疫双向扩散法 【基本原理】*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。*优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。免疫

9、双向扩散法的操作步骤*将玻璃板用水洗净后用75乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。*将1agar 融化后，置56水浴。*在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。lm*中心孔加5 l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即m抗原样品，周围孔内每孔加5 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。*观察结果。抗体效价检测的其它方法*环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；*对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；*酶联免疫吸附试验 (elisa)。放血或定期抽血常用以下3种方法*颈动脉放血法：放血量较多，动物不

10、易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。*心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。*静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。放血或定期抽血 (续)*采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血*血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；*加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如bsa、甘油等。抗血清的制备一、动物的选择选择合适的动物进行免疫极为重要。选择时应考虑以直几个因素：抗原与免

11、疫动物的种属差异越远越好；亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔大鼠之间，鸡鸭之间）。抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。抗血清的要求：抗血清可分为r型和h型。h型抗血清用于沉淀反应较难掌握，因而极少应用。抗原的选择：对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔。但是，在某些动物体内有类似的物质或其它原因，对这些动物免疫原性极差，如ige对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类（如胃蛋白酶原等）对山羊等，免疫时皆不易出现抗体。这些物质有时可以用豚鼠（如胰岛素等）、火鸡、甚至猪、狗、猫等作试验免疫。

12、甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。二、免疫剂量、时间和途径免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。抗原需可量多，时间间隔长，剂量可适当加大。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.51mg/只，小动物约0.10.6mg/只。有时主观希望加强免疫效果而不适当地加大剂量，往往会弄巧成拙。因为剂量加大极易造成免疫耐受（免疫抑制）而遭失败。已有证明，几微克的蛋白质也能很好地免疫出抗血清。免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为810点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利。但皮内注射较困难

13、，特别是天冷时更难注入（因佐剂加入后粘度较大）。其他途径还有肌内、腹腔、静脉、脑内等，但较少应用。如抗原极为宝贵可采用淋巴结内微量注射法，抗原只需10100g；方法是先用不完全佐剂在足作基础免疫（预免疫），1015天后可见肘窝处有肿大的淋巴结（有时在腹股沟处触及），用两手指固定好淋巴结，消毒后用微量注射器直接注射入抗原（一般不需要佐剂）。免疫间隔时间也是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔1020天为好。二次以后每次的间隔一般为710天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。对于

14、半抗原的免疫间隔则要求较长，有的报告1个月，有的长达4050天，这是因为半抗原是小分子，难以刺激机体发生免疫反应之故。免疫的总次数多，多为58次。如为蛋白质抗原，第八次免疫未获得抗体，可在3050天后再追加免疫一次；如仍不产生抗体，则应更换动物。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体，有时总时间为一年以上。三、动物采血法动物免疫35天后，如抗血清鉴定合格（见下节），应在末次免疫后57天及时采血，否则抗体将会下降。因故未及时取血，则应补充免疫一次（肌肉、腹腔或静脉内注射，不加佐剂），过57天取血。1颈动脉放血法这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。在动物颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见

15、斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离（连同与之同行的迷走神经），用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端放入瓶口，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快，动物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时，暂时将动脉夹住片刻，再继续放血，得血量可以多些。另外一种慢放血法是在动脉内插入一采血器，用闭式放血。在颈动脉内插入一较粗的玻璃管，将血管与玻璃管用线扎牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也极为方便。2心脏采血法此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动

16、物。采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。3静脉多次采血法家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法，一只家兔可采百余毫升血液（用颈动脉放血最多可获7080ml，一般只有50ml左右）。用颈静脉采集绵羊血，一次可放300ml，放血后立即回输10葡萄糖盐水，三天后仍可采血200300ml。动物休息一周，再加强免疫一次，又可采血二次。如此，一只羊可获15002000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超过2ml。抗血清的分离多采用室温自然凝固，然后放置37或4待凝块收缩。前者迅速，但得血清较少；后者时间长，有时还会出

17、现溶血，但获得血清多，而且效价不会下跌。抗血清分出后是否要经5630min灭活有两种不同意见。一种认为血清中有许多活性酶，特别是球蛋白的降解酶，如不清除，血清存放过程中将导致抗体效价下降。另外的意见认为，这种自然降解是微不足道的，56加温后，有些球蛋白会发生热变性或者热聚合。含这种聚合大分子蛋白的抗血清用于免疫浊度试验时，可因沉淀剂（如peg）的加入而发生假性混浊。四、抗血清的处理和保存将采血浆静置1-2小时，3000rpm离心，15分钟，取上层血清，56水浴30分钟，灭活后分装，-30冷冻保存抗原的制备除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗

18、原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。一、抗原的提取抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心

19、和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。抗原物质的制备，大概要经过如下过程：材料的选择和预处理；细胞的粉碎（细胞器的分离）。提取；纯化；浓缩或干燥，保存。现分别简述如下。（一）材料的选择及预处理选择什么材料主要根据实验目的而定。通常选含量高、工艺简便、成本低的材

20、料。材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。（二）细胞的粉碎除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。不同的组织，细胞的破碎难易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如脑、胰、肝等比较软嫩的组织，用普通匀浆器研磨就行，肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。1物理法（1）高速组织捣碎机：通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机

21、玻璃筒等组成。把材料放于筒内（约占筒内容积的1/3）固定筒盖，开动马达，调速器由慢逐渐增至所需速度。此法适用于内脏组织。（2）玻璃匀浆器：由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状（球面经过磨砂）玻璃研杆组成。把绞碎的组织置于管内，加适量溶液，插入研杆，用手或电动转动研杆，并上下移动。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。是粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。（3）超声波处理法：多用于软嫩组织，根据不同组织采用不同频率，处理1015min，超声波处理时溶液温度升高，使不耐热的物质失活，使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温，避免溶液内存在气泡。核酸及某些

22、酶对超声波很敏感，要慎用。（4）反复冻融法：把待碎样品冷却到零下1520。c，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，可使大部分动物性细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。（5）冷热交替法：把材料投入90。c左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。2化学和生物化学法（1）自溶法：把新鲜材料置于一定的ph和适宜的温度下，利用组织细胞自身的酶系统把组织破坏，使细胞内容物释放出来。动物材料的自溶温度选在04，需加少量防腐剂，自溶时间较长，不易控制，不常用。（2）溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100g至1m

23、g溶菌酶，37，保温10min，细胞就破坏了。此外，蜗牛酶、纤维素酶也被选作破碎细菌细胞之用。（3）表面活性剂处理法：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。（三）抗原的提取提取、抽提、萃取这3个词的含义基本相同。但一般说来，提取是指在分离纯化前期，将经过处理或粉碎了的细胞置于一定条件和溶剂中，让被提取物充分地释放出来的过程，而抽提则是贯穿于分离纯化的整个过程中，如在制备核酸过程中，用氯仿反复提取蛋白液，用苯酚反复抽提分离dna和rna。影响提取的因素主要来自被提取物在提取的溶剂中的溶解度大小以及它由固相扩散到液相的难易。一个物质在某一溶剂中的溶解度大小和该物质的分子结构及使

24、用的溶剂的理化性质有关。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性大分子的等电点远的ph值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取过程中，所选用的溶剂的性质、ph值、离子强度、抽提温度、介电常数等因素是提取成败的重要因素。要达到分离提纯的目的，必须灵活地应用这些因素。现将蛋白质、核酸、多肽等抗原（半抗原）的提取方法概要叙述于下。1蛋白质和酶的提取蛋白质是由许多氨基酸连接而成的高分子物质，分子量从数千至百万。数以千计的蛋白质，按它们的功能可分成两大类，一类是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受体蛋白、运动蛋白、运输和贮存蛋白、防御蛋白等等，另一类是非活性蛋白，如胶原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白

25、质由于其结构的差异，它们溶解度也各不相同。大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于有机溶剂乙醇、丙酮、丁醇等。这对选择撮蛋白质的溶剂具有重要意义。（1）水溶液提取：由于蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液，因此提取蛋白质以水溶液为主，其中尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质稳定性好，溶解度大，氢是最常用的溶剂。应注意下列几点：盐浓度，常用等渗溶液，尤以0.020.05mol/l磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/l氯化钠溶液应用较多。如酵母脱氢酶以0.66mol/l磷酸氢二钠溶液提取，6-磷酸葡萄糖脱氢酶以0.1mol/l碳酸氢钠液提取，脱氧核糖核蛋白在低盐溶液中

26、溶解度小，就要用1mol/l以上的氯化钠液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低盐溶液提取效果更好。ph值的选择对蛋白质提取颇为重要，因为蛋白质的溶解度和稳定性与ph值关系很大。提取液的ph值首先要保证在蛋白质稳定的范畴内，通常在等电点的两侧，碱性蛋白如细胞色素c和溶菌酶选在偏酸一侧，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶应选在偏碱一侧。温度：为防止活性蛋白变性、降解而失活，温度通常选在5以下。对少数耐温的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提纯，如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶以及许多多肽激素可选择3750条件下提取，效果比低温提取更好。（2）有机溶剂提取：一些不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液

27、的蛋白质和酶，常用不同比例的有机溶剂来提取。如用70%80%乙醇提取麸蛋白；用60%70%的酸性乙醇提取胰岛素，既可抑制水解酶对胰岛素的破坏，又可除去大量杂蛋白，用丁醇提取某些附于微粒体和线粒体的酶，一些与脂质结合牢固的蛋白质和酶以丁醇提取，效果较好。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸脂酶。丁醇提取法对ph及温度的选择范围较广（ph310）,温度由零下240均可。2核酸的提取核酸分为两大类：一类为核糖核酸（rna），另一类为脱氧核糖核酸（dnd）。核酸的分子量极大，人数万致亿万。核酸是两性化合物，在一定的等电点。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常

28、和蛋白质结合成核蛋白。核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别，有一定浓度范围的氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降，当氯化钠浓度为0.14mol/l时，其溶解度仅为水中溶解度的1/100，但当氯化钠浓度再增加时，脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化钠浓度增加到0.5mol/l时，其溶解度与水中溶解度相似，当氯化钠浓度增加到1mol/l时，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/l氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度，因此常用0.14mol/l氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而提取脱氧核糖核蛋白时，则用1mol/l氯化钠溶液。两种核糖核

29、蛋白的溶解度与溶液的ph也有关。当ph为4.2时，脱氧糖核蛋白的溶解度最低，而ph为2.02.5时，核糖核蛋白的溶解度最低。所以调节氯化钠溶液的浓度和ph值，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。（1）rna的提取：rna在细胞中主要有三种类型，即rrna（核微粒核糖核酸）、trna（转移核糖核酸）和mrna（信使核糖核酸）。mrna代谢极不稳定，提取时要求条件较严格；trna当细胞破碎后，用酸处理得到“ph5”沉淀，即可从中分离trna；rrna占全部rna的80%以上，比较稳定，一般提取的大分子rna主要为此部分。核内rrna常先将细胞核分离后，再进行提取，可避免其他细胞组分rna的干扰

30、。rna的提取，通常是用0.14mol/l氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白，而留下含有dna的细胞核物质，然后用10%醋酸调至ph4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5mol/l氯化钠溶液，后用水洗涤沉淀，将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/l碳酸氢钠溶液中，离心，取上清液，调ph至4.2,沉淀以0.5mol/l氯化钠溶液洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氢钠水溶液中，加入乙醇，rna即以钠盐形式沉淀出来。提取rna另一类方法，不须事先用0.14mol/l氯化钠提取核糖核蛋白，而一步将rna的蛋白质分开，并同时把r

31、na抽提出来，此类方法是在破碎细胞做成匀浆时，加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠；而现在最常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡，dna和蛋白质沉淀于酚层中，水层中含rna和多糖，然后用乙醇使rna沉淀，四种物质一步便可初步分离开。苯酚法是目前提取不降解的rna最有效的方法，其应用举例如下：肝脏rrna的提取：按肝重（鲜）加入10倍容积苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸馏水中，另加入0.5g 8-羟基喹啉配成）及10倍容积的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/v）做匀浆后在20搅拌20min。肝脏细胞核内mrna的提取：先分离细胞核，再将核悬浮于3倍容积的

32、0.5%ph6.5的萘二磺酸水溶液（g/v）中匀浆后加入等量90%（g/v）苯酚水溶液（内含0.1%8-羟基喹啉）在2振荡提取30min。酵母trna的提取：100g酵母（湿重）加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振荡2h,4冰箱中过液，使之提取完全。以上介绍了用冷酚法提取各种rna的一些实例，近来还有皂土酚法（即除苯酚外还加入皂土吸附蛋白质）提取rna，据报道比普通酚法提取rna的生物活性高10倍左右。但应用苯酚法提取核酸时，须注意市售苯酚常含有少量重金属和杂质，可能导致核酸降解，使用时，一般需要减压重蒸。（2）dna的提取：dna主要存在于细胞核中，天然状态的dna绝大多数是以

33、脱氧核糖核蛋白形式存在。人细胞中提取dna时，一般先获得脱氧核糖核蛋白，再将蛋白质除去，从中分离dna。常用的方法是以1mol/l氯化钠溶液抽提，得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振荡，除去蛋白质。或者在组织细胞破碎后以低浓度0.14mol/l氯化钠溶液（也可用0.1mol/l氯化钠加0.05mol/l柠檬酸代替）反复洗涤除去核糖核蛋白，再以1mol/l氯化钠提取脱氧核糖核蛋白，提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白质。两种方法比较，后一种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取dna时，加入适量去污剂更有助于蛋白质与dna的分离。应用苯酚法也可以提取dna而且不用经过脱氧核糖核

34、蛋白这一步骤，例如大鼠肝匀浆在6%对氨基水杨酸盐溶液内，加入同体积90%苯酚水溶液，室温下提取1h，再经进一步提纯可获得98%99%纯度的dna。苯酚法也是目前提取dna最常用的方法之一。3活性多肽及递质的提取大体上与蛋白质的提取方法相似，可参照进行。经典神经递质如去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等均可化学合成，无需用很多精力去提取。（四）抗原的分离与纯化从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的，必须进一步分离纯化才能获得纯品。在生物大分子制备工作中，分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。对于异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸，提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖，一般可用专一性酶水解、

35、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。而对同类物质，如酶和杂蛋白，rna和dna以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离，情况则复杂得多，主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。本节侧重对蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法作一简要叙述。1蛋白质分离纯化的一些方法（1）盐析法原理：盐析法对于许多

36、非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。盐的

37、选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25时饱和溶解度为4.1mol/l,即767g/l;0时饱和溶解度为3.9mol/l，即676g/l），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力比较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30以上溶解度太低。其他的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。硫酸铵浓溶液的ph在

38、4.55.5之间，市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸，ph值往往降至4.5以下，当用其他ph值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。硫酸铵饱和度计算法及加入方式：在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。一是当蛋白质溶液体积不大，所需调整的浓度不高时，可加入饱和硫酸铵溶液；饱和硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵，热至5060保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0或25下平衡12天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算：式中v及v0分别代表所需饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积，s2及s1分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严

39、格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于2%。故可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加入固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：式中x是将1升饱和度为s1的溶液提高到饱和度为s2时所需硫酸铵的重量（g），g及a为常数，与温度有关。g在0时为707，20时为0.29。为方便起见，在室温及时所需硫酸铵的饱和度可直接查表2-1、表2-2求出。表21室温下由s1提高到s2时每升加固体硫酸铵的克数 0.10 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70

40、0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 0 55 113 114 175 209 242 278 312 350 390 430 474 519 560 608 657 708 760 0.10 57 67 118 149 182 215 250 287 325 365 405 448 494 530 585 634 685 0.20 29 59 90 121 154 188 225 260 298 337 379 420 465 512 559 610 0.25 29 60 91 123 157 192 228 265 304 345 386 430 475 521 57

41、1 0.30 30 61 93 125 160 195 232 270 310 351 394 439 485 533 0.35 30 62 94 128 163 199 235 275 315 358 403 449 495 0.40 31 63 96 131 166 205 240 280 322 365 410 458 0.45 31 64 98 133 169 206 245 286 330 373 420 0.50 32 63 100 135 172 211 250 292 335 380 0.55 33 66 101 138 176 214 255 298 344 0.60 33

42、67 103 140 179 219 261 305 0.65 34 69 105 143 182 224 267 0.70 34 70 108 146 187 228 0.75 35 72 110 149 170 0.80 36 73 112 152 0.85 37 75 114 0.90 37 76 0.95 38 盐析时注意的几个问题1）盐的饱和度：盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中

43、的蛋白质，饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和度增至28%33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至33%50%时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时，白蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，从牛胰中酸性提取分离可得到九种以上蛋白质及酶。2）ph值：在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出，因此，盐析时除个别情况外，ph值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。3）蛋白质浓度：在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低，如血清球蛋白的溶度从0.5%增到3.0%时，需用中性盐的饱和度的最低极限从29%递减至24%。某一蛋白质欲进行两次盐析时，第1次由于浓度较稀，盐析分段范围

44、较宽，第2次则逐渐收窄，例如用硫酸铵盐析胆碱酯酶时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%，第2次为40%至60%。蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利，但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉作用的干扰。表2-2 0下由s1提高到s2时每100ml加固体硫酸铵的克数溶液的原始饱和度（%） 饱和度 在0时所达到硫酸铵饱和度（%） 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 在100毫升中欲加固体硫酸铵的克数 0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.

45、8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7 5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2 10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7 15 2.6 5.4 6.2 11.1 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2 20 0 2

46、.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7 25 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2 30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8 35 0 2.8 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.4 29.1 32.9 36.9 41.0 45.3 40 0 2.9

47、 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 25.8 29.6 33.5 37.6 41.8 45 0 2.9 5.9 9.0 12.3 15.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3 50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.0 26.8 30.8 34.8 55 0 3.0 6.1 9.3 12.7 16.1 19.1 23.5 27.3 31.3 60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.4 20.1 23.9 27.9 65 0 3.1 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 21.4 70 0 3.2 6.

48、5 9.9 13.4 17.1 20.9 75 0 3.2 6.6 10.1 13.7 17.4 80 0 3.3 6.7 10.3 13.9 85 0 3.4 6.8 10.5 90 0 3.4 7.0 95 0 3.5 100 0 4）温度：由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。虽然蛋白质在盐析时对温度要求不太严格，但在中性盐下结晶纯化时，温度影响则比较明显。5）脱盐：蛋白质、酶用盐析法沉淀分离后，常需脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析法，如图2-1所示：把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的二端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲

49、液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。透析需要较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。此外用葡聚糖凝胶脱盐的效果也很好，其原理和应用方法在这里不赘述。图2-1透析装置图（2）有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高

50、浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的ph值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/l左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺

51、点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。（3）等电点沉淀法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特别进行分离的方法，称为等电点沉淀法。但在等电点时，各种蛋白质仍有一定的溶解度而使沉淀不完全，同时许多蛋白质的等电点十分接近，故单独使用此法效果不理想，分辨力也差。大多用于提取后去除杂蛋白，即利用变动提取液的ph值使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉淀出。实际工作中常把等电点沉淀和盐析法、有机溶剂沉淀法联合使用。（4）吸附法：在蛋白质的提纯方法中，选择性吸附也是应用历史较久迄今仍在广

52、泛采用的方法之一。早期工作常用高岭土 （我国的一种土质，其分子式大致是al2o32sio22h2o）、氧化铝（al2o3）及活性炭等吸附剂，由于这些吸附剂吸附力较弱，或者易引起蛋白质变性而应用不广，现已为凝胶性吸附剂所代替，如氢氧化铝凝胶和磷酸钙凝胶，尤其后者使用最广。吸附剂的应用有两种不同方式。当蛋白质较易吸附时，可以选择适当条件主要吸附蛋白质而分离去杂质；当蛋白质较难吸附时，则选择利于吸附杂质条件将杂质与蛋白质分开。有时两种方法可先后使用，以达到较高的提纯目的。吸附条件通常在微酸性条件（ph56）及稀盐溶液中进行，盐浓度过高会干扰对蛋白质及酶的吸附，亦即是说需要用更多量的吸附剂才能达到一定

53、结果。洗脱时一般在弱碱条件下或适当提高洗脱液离子强度，可将吸附的蛋白质或酶完全洗脱下来。吸附操作可以用静态吸附，也可以用柱层析吸附，即将凝胶装成柱进行吸附操作。凝胶装柱后如溶液的通过能力很差，可用助滤剂（如硅藻土）和凝胶混合，当调整二者的比例时得到一系列通过能力和吸附能力不同的层析柱。最近还使羟基磷灰石ca10(po4)6（oh）2分离蛋白质和酶，它可以在高盐浓度下吸附中性及酸性蛋白质而排除碱性蛋白质。吸附常在ph6.8的磷酸缓冲液中进行。洗脱完全时凝胶可反复使用34次，吸附杂质较多的凝胶以0.1mol/l氢氧化钠或1mol/l盐酸洗净后再用。（5）离子交换法：蛋白质和酶都具有电解质性质，故可

54、用离子交换剂进行分离提纯，特别是经过了初步纯化后的蛋白质和酶采用此法效果尤为显著。有关离子交换剂及其使用技术，参阅有关专著，这里介绍近年来以纤维素衍生物作为离子交换剂纯化蛋白质及酶的方法。在这类衍生物中以二乙氨基乙基纤维素（简称deae-纤维素，为阴离子交换剂）及甲基纤维素（简称cm-纤维素，为阳离子交换剂）应用最广泛。deae-纤维素是纤维素结构中的氢原子被一定量的二乙氨基-乙基取代而成弱碱性化合物，它作为阴离子交换剂的原理是：在实际工作中常用磷酸缓冲液平衡deae-纤维素后，才对蛋白质进行交换吸附的，故上式b-可视为po3-。用deae-纤维素吸附酶和蛋白质时常用ph为79，然后提高盐浓度

55、（使蛋白质与交换剂的结合键减弱）或降低ph使之洗脱，洗脱后的蛋白质溶液有时可进一步上cm-纤维素柱纯化。作为阳离子交换剂，cm-纤维素吸附蛋白质的原理如下：式中a+可为h+或na+，视平衡cm纤维素时所用溶剂而定。cm纤维素常选在ph4.56.0左右吸附蛋白质，然后提高ph或盐浓度进行洗脱。离子交换纤维素对大分子物质有较大交换量，例如cm-纤维素对血红蛋白的交换量为9398mg/100mgcm-纤维素。此外，纤维素离子交换剂还具有层析条件温和、物质易于洗脱、分辨力强、被分离的蛋白质不易变性等优点。除了纤维素离子交换剂外，离子交换凝胶也是目前应用于分离蛋白质和酶的一种很好的离子交换剂。常用的有d

56、eae-葡聚糖凝胶和cm-葡聚糖凝胶。离子交换凝胶不仅具有交换当量高、层析条件温和、操作简便等优点，而且兼具分子筛的性能，在梯度洗脱时，对不同分子量的蛋白质具有很高的分辨能力。2核酸的分离纯化从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在04的低温条件下操作。核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入edta、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有