基因工程第二章DNA重组克隆操作

1、基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2 DNA重组的单元操作 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 基因工程载体必需具备的基因工程载体必需具备的4 4个基本条件个基本条件 具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载 体导入受体细胞的效率。体导入受体细胞的效率。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位 点。点。 具有多种单一限制性内切酶位点。具有多种单一限制性内切酶位点。 具有合适的选择标记基因。具有

2、合适的选择标记基因。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.1 DNA重组的载体重组的载体 2.1.1 质粒载体质粒载体 一、质粒的一般生物学特性一、质粒的一般生物学特性 （一）质粒（一）质粒DNA的分子特性的分子特性 1、自主复制性、自主复制性 已知的绝大多数质粒都是双链闭合环状已知的绝大多数质粒都是双链闭合环状DNA分子。除了酵分子。除了酵 母的杀伤质粒是一种母的杀伤质粒是一种RNA分子外，其他已知的所有质粒无分子外，其他已知的所有质粒无 一例外地都是一例外地都是DNA分子。分子。 质粒质粒DNA分子分子 的三种构型的三种构型 闭合

3、环状闭合环状DNA（ccDNA），），即即SC构型构型 开环开环DNA（ocDNA），），即即OC构型构型 线形线形DNA（lDNA），），即即L构型构型 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2 2、可扩增性、可扩增性 3 3、质粒的不相容性、质粒的不相容性 严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1 13 3个个 松驰型质粒：其拷贝数较多，一般松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20206060个，多的可达个，多的可达 200200300300个个 。 质粒的不亲和性（也称为不相容性）：是指

4、在没有选择压力质粒的不亲和性（也称为不相容性）：是指在没有选择压力 的情况下，两种不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定共存的情况下，两种不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定共存 的现象。的现象。 在细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉，在细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉， 这样的两种质粒称为不亲和质粒。这样的两种质粒称为不亲和质粒。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 4、质粒的转移性、质粒的转移性 结合型质粒（结合型质粒（conjugative plasmid）又叫自我转移型质粒，其又叫自我转移型质粒，其 分子量

5、一般都比较大，除携带自主复制所必需的遗传信息外，分子量一般都比较大，除携带自主复制所必需的遗传信息外， 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此能从一还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此能从一 个细胞自我转移到另一个细胞中。个细胞自我转移到另一个细胞中。 非接合型质粒非接合型质粒(nonconjugative plasmid)又叫不能自我转移型又叫不能自我转移型 质粒，其分子质量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信质粒，其分子质量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信 息，但不携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不息，但不携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不 能

6、从一个细胞自我转移到另一个细胞中。能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。 质粒的迁移作用：如果在非转移型质粒的宿主细胞中存在一质粒的迁移作用：如果在非转移型质粒的宿主细胞中存在一 种相容的接合型质粒，那么它也会被自我转移。这种由共存种相容的接合型质粒，那么它也会被自我转移。这种由共存 的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移，叫做质粒的迁移的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移，叫做质粒的迁移 作用。作用。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 二、理想质粒载体的必备条件二、理想质粒载体的必备条件 （一）天然质粒用做载体的局限性（一）天然质粒用做载

7、体的局限性 1. pSC101 大小：9.09kb 严谨性质粒 具有多个限制 酶的单一切点 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （二）理想质粒载体的必备条件（二）理想质粒载体的必备条件 1、具有较小的分子量和较高的拷贝数。、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 2、具有若干限制性内切酶的单一酶切位点。、具有若干限制性内切酶的单一酶切位点。 3、具有两种以上的选择标记基因。、具有两种以上的选择标记基因。 4、缺失、缺失mob基因。基因。 5、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达

8、。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 三、质粒载体的构建三、质粒载体的构建 （一）（一）pBR322质粒载体的构建质粒载体的构建 1、组成、组成 来自来自pSCl01的四环素的四环素 抗性基因抗性基因Tetr 来自来自ColEl的衍生物的衍生物 pMBl的松弛复制起点的松弛复制起点 ori 来自来自RSF2124的氨苄的氨苄 青霉素抗性基因青霉素抗性基因Ampr。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2 2 特点特点 具有多个单一的限制性内切酶位点。具有多个单一的限制性内切酶位点。

9、 Tetr中有中有BamHI切点（切点（GGATCC）和和Sal切点（切点（GAATTC），）， Ampr中有中有Pst切点（切点（CTGCAG）。 利用利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒 拷贝数进一步扩增。拷贝数进一步扩增。 具有较小的分子量。具有较小的分子量。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 3 重组克隆的重组克隆的 “插入失活插入失活”筛选方法筛选方法 pBR322插入在插入在Tetr中，基因型为中，基因型为Tets 、Ampr在含有氨在含有氨

10、卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长；卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长； pBR322插入在插入在Ampr中，基因型为中，基因型为Tetr 、Amps、在含在含 有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长；有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个 基因位点中插入外源基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫片段，从而使该基因活性丧失的现象叫 插入失活插入失活。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINE

11、ERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 Amp r Tet r Tet rAmp s PstI . . . . . . . . 涂布有涂布有Tet的培养基的培养基涂布有涂布有Amp的培养基的培养基 . . . . . . 重组体的筛选重组体的筛选 外源基因的插入：外源基因的插入： . 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 四、常用的质粒载体四、常用的质粒载体 （一）克隆质粒载体（一）克隆质粒载体 具有更小的分子具有更小的分子 量（量（2 686bp） 具有多克隆位点具有多克隆位点 1、 pBR322质粒及其派生质粒质粒及其派生质粒 2

12、、 pUC系列质粒载体系列质粒载体 具有更高的拷贝数。具有更高的拷贝数。 可用组化方法筛选可用组化方法筛选 重组体，更方便、重组体，更方便、 更省时。更省时。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 可用组化方法鉴别：可用组化方法鉴别： 含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因基因 （LacZ），），它编码它编码-半乳糖苷酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸个氨基酸 ， 可以和可以和-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即即-互补互补 ，恢复分解乳糖的

13、能力。，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是也是-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无-半乳糖苷酶时，半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到当外源基因插入到pUC质质 粒的粒的LacZ基因内部，则基因内部，则LacZLacZ基因受到破坏，便不能基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此，半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。反之，非重组体为蓝色菌

14、落。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 lacZ lacZ N端端 C端端 缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌 完整的完整的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （二）表达质粒载体（二）表达质粒载体 表达载体应含有：表达载体应含有： （1）强启动子）强启动子 （2）在启动子下游区和）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的上游区有一个好的SD序列。序列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序 列，保证外源

15、基因有效转录和质粒的稳定性。列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。 表达载体可分为表达载体可分为 非分泌型表达载体非分泌型表达载体 分泌型表达载体分泌型表达载体 原核细胞表达载体原核细胞表达载体 真核细胞表达载体真核细胞表达载体 或或 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 例：例：pBV221 （1）利用利用噬菌体的噬菌体的PL、PR作为串联启动子。一个温度敏作为串联启动子。一个温度敏 感的转录阻遏蛋白感的转录阻遏蛋白cI857基因位于其上游。基因位于其上游。 （2）在多克隆位点的下游有一强转录终止序列）在多克隆位点的下游有一强转录终止序

16、列rrnB。 （3）在多克隆位点与启动子之间有在多克隆位点与启动子之间有SD序列。序列。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （三）多功能质粒载体（三）多功能质粒载体 这类载体具有多种功能，它可根据需要进行体外转录、克隆、这类载体具有多种功能，它可根据需要进行体外转录、克隆、 测序、基因表达等方面的基因操作。测序、基因表达等方面的基因操作。 例如：例如：pGEM系列质粒载体。系列质粒载体。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （四）穿梭载体（四）穿梭载体 穿梭质粒载体：是指一类由人工

17、构建的具有两种不同复制穿梭质粒载体：是指一类由人工构建的具有两种不同复制 起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和 复制的质粒载体。复制的质粒载体。 常见的有：大肠杆菌常见的有：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆 菌菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭酿酒酵母穿梭 质粒载体等。质粒载体等。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.1.2 双链噬菌体双链噬菌体DNA载体载体 一、 噬菌体的生物学特

18、性噬菌体的生物学特性 （一） 噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期 裂解性周期（溶菌周期）裂解性周期（溶菌周期） 溶原性周期溶原性周期 （二）（二） 噬菌体的基因组结构和功能噬菌体的基因组结构和功能 噬菌体颗粒中噬菌体颗粒中DNA为线状双链为线状双链DNA分子，全长分子，全长48 502bp， 两端各有一段长度为两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端）。当个核苷酸的互补单链（粘端）。当DNADNA 进入细菌细胞后，便迅速通过粘性末端配对形成双链环状的进入细菌细胞后，便迅速通过粘性末端配对形成双链环状的 DNADNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区段称为分子，这种由粘性末端结合形成的双链

19、区段称为cos位点。位点。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGA T A C G 环化作用环化作用 5 53 3 cos位点位点 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 噬菌体有噬菌体有6161个基因，其中有个基因，其中有1/31/3的区域是其裂解性生长的区域是其裂解性生长 的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNADNA， 并不影响噬菌体的增殖，这就是并不影响噬菌体的增殖，这就

20、是噬菌体可作为基因载体的噬菌体可作为基因载体的 依据依据 。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 人为地将噬菌体基因组分为噬菌体基因组分为3 3个区域：个区域： （1 1）左侧区，自基因）左侧区，自基因A A到基因到基因J J，包含外壳蛋白的全部编码包含外壳蛋白的全部编码 基因。基因。 （2 2）中间区：介于基因）中间区：介于基因J J与基因与基因N N之间，又称非必需区。之间，又称非必需区。 （3 3）右侧区：位于）右侧区：位于N N基因的右侧，包含全部的主要调节基因基因的右侧，包含全部的主要调节基因 及复制基因和裂解基因。及复制基因和

21、裂解基因。 A W B C D E F ZUVGH M L K I J b2 att int xis gam red cIII N cI cro cII O P Q S R 左侧区左侧区 中间区中间区 右侧区右侧区 图图3-7 3-7 噬菌体基因组噬菌体基因组简图简图 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （三）（三） 噬菌体的噬菌体的DNADNA复制复制 裂解周期：裂解周期： 早期：早期：型进行双向复制型进行双向复制 晚期：复制从晚期：复制从型变为滚环复制型变为滚环复制 线性的线性的DNA多聚体不能被包装进头部，必须经过核酸酶的多聚体不能

22、被包装进头部，必须经过核酸酶的 切割作用，从切割作用，从cos位点将它分成单位长度的单体分子，才能够位点将它分成单位长度的单体分子，才能够 被包装起来。已知在头部入口处，有被包装起来。已知在头部入口处，有4种蛋白质参与了这种切种蛋白质参与了这种切 割过程，它们能识别双链线性割过程，它们能识别双链线性DNA分子上的分子上的cos序列，并在序列，并在 cos序列处切断序列处切断DNA分子，使一个正确大小的分子，使一个正确大小的DNA分子进入分子进入 头部。所以，头部。所以， cos位点是位点是噬菌体正确包装的必需位点。噬菌体正确包装的必需位点。 溶原性周期：稳定的整合到宿主染色体并随之一起复制。溶

23、原性周期：稳定的整合到宿主染色体并随之一起复制。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 二、构建二、构建噬菌体载体的基本原理噬菌体载体的基本原理 噬菌体的改造噬菌体的改造 基因组太大（基因组太大（49kb）；）； 酶切点太多，它有酶切点太多，它有5个个BamH1位点（位点（GGATCC），），6个个Bg位点位点 （AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于若相当于噬菌体的噬菌体的75-105%， 那么只能接纳那么只能接纳49kb5%=2.45kb的的D

24、NA。 缩短野生型的长度，扩充缩短野生型的长度，扩充噬菌体载体噬菌体载体的克隆容量；的克隆容量； 删除重复的酶切位点；删除重复的酶切位点； 通过在某些非必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于生通过在某些非必需基因中引入无义突变使之成为安全载体，以利于生 物学防护。物学防护。 (4)引入合适的选择标记基因（引入合适的选择标记基因（remarke gene）。）。 噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷： 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （二）构建（二）构建噬菌体载体的基本内容噬菌体载体的基本内容 1、去除多余的限制酶识别位点、去除多余的限制

25、酶识别位点 主要是利用大肠杆菌限制与修饰系统，采用体内遗传重组技主要是利用大肠杆菌限制与修饰系统，采用体内遗传重组技 术，筛选在必需区没有限制酶切位点而非必需区有术，筛选在必需区没有限制酶切位点而非必需区有1个或个或2个个 合适的限制酶位点的突变体。合适的限制酶位点的突变体。 2 2、切除、切除DNADNA的非必需区段的非必需区段 要注意选择适当的载体与外源要注意选择适当的载体与外源DNADNA的组合，以便重组噬菌体的组合，以便重组噬菌体 DNADNA大小处于可接纳的范围内。大小处于可接纳的范围内。 3、引入适当的选择标记。、引入适当的选择标记。 如：在如：在噬菌体载体的非必需区插入噬菌体载体

26、的非必需区插入lacZ基因。基因。 4、引入无义突变、引入无义突变 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 三、常用的三、常用的噬菌体载体噬菌体载体 （一一）插入型载体）插入型载体 只有一个只有一个限制性核酸内切酶的单一切割位点。限制性核酸内切酶的单一切割位点。 可承载可承载10kb以下的外源以下的外源DNA片段。片段。 免疫功能失活的插入型载体免疫功能失活的插入型载体 -半乳糖苷酶失活的插入型载体半乳糖苷酶失活的插入型载体 ZAPZAP插入型载体插入型载体 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克

27、隆操作 （二）取代型载体（二）取代型载体 具有具有2 2个限制性内切酶的酶切位点，它们之间的个限制性内切酶的酶切位点，它们之间的DNADNA区段可被区段可被 外源插入的外源插入的DNA分子取代。分子取代。 可承载可承载20kb20kb左右的外源左右的外源DNADNA片段。片段。 Charon系列取代型载体系列取代型载体 EMBL系列取代型载体系列取代型载体 Spi正选择取代型载体正选择取代型载体 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.1.3 M132.1.3 M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNA载体载体 单链单链DNADNA噬菌体载体

28、主要是由噬菌体载体主要是由M13M13噬菌体构建发展起来的一噬菌体构建发展起来的一 类载体。具有以下优越性：类载体。具有以下优越性： （1）它们不存在包装限制问题。）它们不存在包装限制问题。 （2）可从噬菌体颗粒中产生大量含有外源）可从噬菌体颗粒中产生大量含有外源DNA序列的单链序列的单链 的的DNA分子。分子。 （3）应用这类载体，可以容易地测定出外源）应用这类载体，可以容易地测定出外源DNA片段的插片段的插 入方向。入方向。 （4）可从大肠杆菌细胞中制备双链的复制型）可从大肠杆菌细胞中制备双链的复制型DNA。 （5）其两种形式的其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆菌，分子都能够转

29、染感受态的大肠杆菌， 或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 一、一、M13M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 （一） M13M13噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构 M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA， 6407bp，其中其中90%的的DNA都编码蛋白质，有都编码蛋白质，有10个基因，有两个基因，有两 个较长的间隔区。个较长的间隔区。 在基因在基因II和基因和基因IV之间有一个长度为之间有一个长度为5

30、07个核苷酸的基因间个核苷酸的基因间 区段，虽然其上存在着复制起始点，但基因区段，虽然其上存在着复制起始点，但基因II和基因和基因V的某的某 些突变可部分补偿因外源基因插入而失活的负责复制调控的些突变可部分补偿因外源基因插入而失活的负责复制调控的 顺式作用序列的功能。因此，外源基因在此插入，并不影响顺式作用序列的功能。因此，外源基因在此插入，并不影响 噬菌体噬菌体DNA的复制。的复制。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （二）（二） M13M13噬菌体复制、感染和包装噬菌体复制、感染和包装 1、以（、以（+）链）链DNA为摸板，为摸板，

31、合成互补（）链，该双链称合成互补（）链，该双链称 复制型复制型DNA（RFDNA）。）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞 约约200个拷贝。个拷贝。 3 3、单链特异的、单链特异的DNADNA结合蛋白结合在（结合蛋白结合在（+ +）链上，从而阻断了）链上，从而阻断了 其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合 成（成（+ +）链）链DNA DNA 。 4 4、游离出来的（游离出来的（+ +）链）链DNADNA先与基因先与基因V V的编码产物形成特异的编码产物形成特异 的的DNA

32、-DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V V 的蛋白质从（的蛋白质从（+ +）DNADNA链上脱落下来，余下的链上脱落下来，余下的M13M13（+ +）链链DNADNA 则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳 蛋白包装成病毒颗粒的。蛋白包装成病毒颗粒的。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 + + - - + - - + - - + - - + - - + - - 单链结合蛋白单链结合蛋白 RF型型DNA 复制约复制约

33、 200copy + + + 以以- -链链DNA为模为模 板合成板合成+链链DNA 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 一、黏粒载体的基本特点黏粒载体的基本特点 （1） 有有噬菌体的体外包装、高效感染等特性。噬菌体的体外包装、高效感染等特性。 （2） 有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。 （4 4）具有与同源序列的质粒进行重组的能力。）具有与同源序列的质粒进行重组的能力。 （3 3）具有高容量的克隆能力。）具有高容量的克隆能力。 2.1.4 噬菌体噬菌体-质粒杂合载体质粒杂合载体

34、基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 噬菌粒的优越性：噬菌粒的优越性： （1）具有质粒的基本性质。）具有质粒的基本性质。 （2）在一定程度上提高了外源）在一定程度上提高了外源DNA片段的装载量。片段的装载量。 （3）M13-DNA重组分子在复制时常会发生重组分子在复制时常会发生DNA缺失，而噬缺失，而噬 菌粒重组分子则相对稳定。菌粒重组分子则相对稳定。 二、噬菌粒载体 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.1.5 人造染色体载体 一、酵母人工染色体（一、酵母人工染色体（YAC） 真核

35、生物染色体的关键部分：着丝粒、端粒和自主复制序列。真核生物染色体的关键部分：着丝粒、端粒和自主复制序列。 YAC是由酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒及是由酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒及 酵母选择标记组成的能自我复制的酵母线性克隆载体。酵母选择标记组成的能自我复制的酵母线性克隆载体。 二、细菌人造染色体二、细菌人造染色体 pBACs 系列系列 三、人类人造染色体三、人类人造染色体 HAC系列系列 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.2 DNA的体外重组（切和接）的体外重组（切和接） 一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切

36、酶 限制性核酸内切酶（简称限制酶限制性核酸内切酶（简称限制酶 restriction enzyme），），是指在是指在 细胞内能够识别双链细胞内能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并在此位分子中特定的核苷酸序列，并在此位 点对点对DNA分子进行切割的一种内切酶。分子进行切割的一种内切酶。 （一）限制性核酸内切酶的发现（一）限制性核酸内切酶的发现 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 限制与修饰系统的作用：限制与修饰系统的作用： 一是保护自身一是保护自身DNA不受限制，不受限制， 二是破坏入侵的外源二是破坏入侵的外源DNA，使之降解。使

37、之降解。 在基因工程中，常采用缺少限制作用的菌株作为受体。在基因工程中，常采用缺少限制作用的菌株作为受体。 限制与修饰系统与三个连锁基因有关：限制与修饰系统与三个连锁基因有关： hsdR：编码限制性核酸内切酶，这类酶能识别编码限制性核酸内切酶，这类酶能识别DNA分分 子上的特定位点并将双链子上的特定位点并将双链DNA切断。切断。 hsdM：编码编码DNA甲基化酶，这类酶能使甲基化酶，这类酶能使DNA分子特定分子特定 位点甲基化，即起修饰作用。位点甲基化，即起修饰作用。 hsdS：协助上述两种酶识别特殊的作用位点。协助上述两种酶识别特殊的作用位点。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINE

38、ERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 宿主细胞对噬菌体感染的限制宿主细胞对噬菌体感染的限制-修饰作用修饰作用 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （二）限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型 性质性质 I 型型 II 型型 III型型 酶分子的结构与功能酶分子的结构与功能 三亚基多功能酶三亚基多功能酶 单一功能酶单一功能酶 二亚基双功能酶二亚基双功能酶 限制与修饰作用的关系限制与修饰作用的关系 酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用 酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用 酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白同时具

39、有甲基化作用 限制作用的辅助因子限制作用的辅助因子 ATP、Mg 2+、SAM Mg 2+ ATP、Mg 2+、SAM 识别序列识别序列 特异性，非对称序列特异性，非对称序列 特异性、旋转对称序列特异性、旋转对称序列 特异性，非对称序列特异性，非对称序列 切割位点切割位点 距识别序列至少距识别序列至少1000bp 在识别序列内部或附近在识别序列内部或附近 在识别序列下游在识别序列下游24-26bp处处 切割方式切割方式 随机切割随机切割 特异切割特异切割 特异切割特异切割 在基因克隆中的用途在基因克隆中的用途 无应用价值无应用价值 应用广泛应用广泛 用处不大用处不大 表表2-1 限制性核酸内切

40、酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （2）型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶 型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。型型 酶需要酶需要Mg2+、ATP和和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因 子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿 DNADNA转位，而后距其识别位点转位，而后距其识别位点5 5侧数千个碱基处随机切割。侧数千个碱基处随机切割。 III

41、型酶与型酶与型酶基本相似，但是型酶基本相似，但是IIIIII型酶具有特异性的切型酶具有特异性的切 割位点，在识别点的割位点，在识别点的3- -端端2426bp处。处。 它的切点与识别位点是一致的。由于它的切点与识别位点是一致的。由于型酶的该特点，型酶的该特点， 且反应中不需要且反应中不需要ATP、S-腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而腺苷甲硫氨酸作为辅因子，因而 是基因工程中使用的主要工具酶。是基因工程中使用的主要工具酶。 （1）型和型和IIIIII型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （三）限制性核酸内切酶

42、的命名（三）限制性核酸内切酶的命名 1、用具有某种限制性核酸内切酶有机体属名的第一个字母限制性核酸内切酶有机体属名的第一个字母 （大写）和种名的前两个字母（小写），组成酶的基本名称。（大写）和种名的前两个字母（小写），组成酶的基本名称。 2 2、如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的第一个字母、如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的第一个字母 加在名称之后；若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，加在名称之后；若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上， 则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。 3 3、如果一种特殊的菌株中，具有几个不同的限制修饰体

43、系，、如果一种特殊的菌株中，具有几个不同的限制修饰体系， 则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。 例如例如: :HindIIIHindIII是在是在Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae( (流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌) )中中d d菌株中发现菌株中发现 的第三个酶的第三个酶; ;EcoRIEcoRI表示在表示在Escherichia coliEscherichia coli( (大肠杆菌大肠杆菌) )中的抗药性中的抗药性R R质粒质粒 上发现的第一个酶上发现的第一个酶. . 基基 因因

44、工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （四）II类限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性 1. II类限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列 （1）识别双链）识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，其长度一般为分子的特定核苷酸序列，其长度一般为 46个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。个核苷酸，且具有双重旋转对称的结构形式。 其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，其中，大写字母代表核苷酸碱基，带撇的大写字母则代表互补的核苷酸碱基，N是代表任是代表任 意一种核苷酸，垂直线代表对称轴。意一种核苷酸，垂直线代

45、表对称轴。 ABC C B A ABNB A AB B A A B C C B A A B N BA A B BA （2 2）在）在DNA 中，若中，若A、T、G、C四种核苷酸以相同频率出现，四种核苷酸以相同频率出现， 那么，一段那么，一段DNA中，某一内切酶识别的位点，即核苷酸随机结中，某一内切酶识别的位点，即核苷酸随机结 合的位点的数量为合的位点的数量为1/4n (n为识别序列的长度为识别序列的长度)。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2. II型限制性核酸内切酶的切割方式限制性核酸内切酶的切割方式 （1 1）粘性末端）粘性末端

46、A A、33突出粘性末端突出粘性末端 如限制酶如限制酶PstI,PstI,它识别它识别6 6核苷酸序列，产生核苷酸序列，产生4 4核苷酸核苷酸3 3- -粘性末粘性末 端序列。端序列。 5 5- -CTCGAG- 3CTCGAG- 3 5 5-CTCGA- -G- 3-CTCGA- -G- 3 3 3-GAGCTC- 5-GAGCTC- 5 3 3-G- -AGCTC- 5-G- -AGCTC- 5 B B、55突出粘末端突出粘末端 如：从流感噬血菌（如：从流感噬血菌（Haemophilus influenzae）分离出来的一分离出来的一 种限制酶种限制酶HindIIIHindIII，其识别序

47、列和切割位点为：其识别序列和切割位点为： 5 5- -AAGCTT- 3AAGCTT- 3 5-A- -AGCTT-3 5-A- -AGCTT-3 3-TTCGAA- 5 3-TTCGA- -A-5 3-TTCGAA- 5 3-TTCGA- -A-5 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （2 2）平端平端 例：限制酶例：限制酶HaeIII，它识别它识别4核苷酸序列，切割点产生平口末端。核苷酸序列，切割点产生平口末端。 5 -GGCC- 3 5 -GG- -CC- 3 3 -CCGG- 5 3 -CC- -GG- 5 基基 因因 工工 程程

48、 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形成同来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形成同 样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 如：如：Hpa和和Msp，它们的识别序列均为它们的识别序列均为CCGG，切割位切割位 点均为点均为CCGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏 感性不同。在不含有甲基时，感性不同。在不含有甲基时，HpaHpa和和MspMsp均可对其切割，均可对其切割， 如果胞嘧啶被修饰为如果胞嘧啶被修饰为5-5-甲基胞嘧啶甲基

49、胞嘧啶C CmCGGCGG，则则MspMsp可以切割可以切割 它，而它，而HpaHpa就不能切割此序列。就不能切割此序列。 同裂酶同裂酶 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 同尾酶同尾酶 来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后DNA分子产分子产 生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶。生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶。 Sal 5 -GTCGAC- 3 5 -G- -TCGAC- 3 3 -CAGCTG- 5 3 -CAGCT -G- 5 和和 Xho 5 -CTCGAG- 3 5 -C-

50、-TCGAG- 3 3 -GAGCTC- 5 3 -GAGCT -C- 5 两个粘性末端再连接后，产生两个粘性末端再连接后，产生 5 -GTCGAG- 3 3 -CAGCTC- 5 该该DNA既不能为既不能为Sal也不能为也不能为Xho所识别。所识别。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 （五）甲基化酶的基本特征（五）甲基化酶的基本特征 II型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担，它们识别型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担，它们识别 相同的相同的DNA序列，但是作用不同。序列，但是作用不同。 例如：例如：EcoRI 限制性核酸内切

51、酶与限制性核酸内切酶与EcoRI甲基化酶，两者均甲基化酶，两者均 识别识别GAATTC序列，而前者能对序列，而前者能对G AATTC序列进行切割，序列进行切割， 后者的作用是使第二个后者的作用是使第二个A甲基化。甲基化。 这类甲基化酶的命名常在相应的限制酶名字前冠以这类甲基化酶的命名常在相应的限制酶名字前冠以M。 例如：例如：HindIII表示限制性核酸内切酶，相应的甲基化酶用表示限制性核酸内切酶，相应的甲基化酶用 M.HindIII表示。表示。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.2.2 DNA连接酶 一、概念和机理一、概念和机理

52、DNADNA连接酶：能够催化连接酶：能够催化DNA中相邻的中相邻的3-羟基和羟基和5-磷酸磷酸 基末端之间形成基末端之间形成3，5-磷酸二酯键的酶。磷酸二酯键的酶。 能源能源 大肠杆菌和其他细菌中：大肠杆菌和其他细菌中：NAD+ 动物细胞及噬菌体中：动物细胞及噬菌体中：ATP 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 催化连接反应步骤；催化连接反应步骤； （1）由）由ATP（或或NAD+）提供）提供AMP，形成酶形成酶-AMP复合物，同复合物，同 时释放出焦磷酸基团（时释放出焦磷酸基团（PPi）或烟酰胺单核苷酸（或烟酰胺单核苷酸（NMN）。）。

53、 （2）激活的激活的AMP结合在结合在DNA链链5端的磷酸基团上，产生含端的磷酸基团上，产生含 高能磷酸键的焦磷酸酯键。高能磷酸键的焦磷酸酯键。 （3）与相邻）与相邻DNA链链3端羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放端羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放 出出AMP。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 DNA连接酶的作用机制图 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 DNA连接酶只能连接连接酶只能连接DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，分子上相邻核苷酸之间的切口， 不能连接裂口。不能连接裂口。

54、A - G C G - T T - C G C - A A - G C G - T T - C G C - A A - G T T - C G C - A 无催化活性无催化活性 DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 二、DNA连接酶的种类 （一）T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 可连接可连接：（：（1）带有互补黏性末端的双链带有互补黏性末端的双链DNA分子。分子。 （2）带有平头末端的双链）带有平头末端的双链DNA分子。分子。 （3）一条链带有切口的双链）一条链带有切口的双链DNA分子。分子。 （4

55、）RNA：DNA杂合体中杂合体中DNA链上的切链上的切 口或口或RNA链上的切口。链上的切口。 （二）大肠杆菌（二）大肠杆菌DNA连接酶连接酶 只能连接带匹配粘末端的只能连接带匹配粘末端的DNA分子分子 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5 5 5 5 (1) (2) AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5 5 AATTC G G CTTAA 5 5 (a)分子间连接分子间连接 (b)分子内连接分子内连接 (1) (2) AT GC TA TA

56、G CTA T4连接酶 T4连接酶 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2.2.3其他用于其他用于DNA重组的工具酶重组的工具酶 一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 是基因工程中常用的一种酶，此酶在全酶时（分子量是基因工程中常用的一种酶，此酶在全酶时（分子量109000D） 主要有主要有3种酶活性：种酶活性： 1、 53聚合酶活性：聚合酶活性： CCG GGCTATCGG E.coli DNApolI Mg 2+，4dNTP CCGATAGCC GGCTATCGG DNApolI 5 33 3 3 5 5 5 2.2.3.1 D

57、NA聚合酶聚合酶 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 2、53外切酶活性外切酶活性 GATAGCC AGCTATCGG TCGATAGCC AGCTATCGG E.coli DNApolI Mg 2+ + pC，pT 5 DNApolI 3 3 5 5 DNApolI 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 水解作用的三个特征：水解作用的三个特征： （1）待切除的核酸分子必须具有）待切除的核酸分子必须具有5端游离磷酸基团；端游离磷酸基团；

58、（2）核苷酸分子被切除前位于已配对的）核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋区段上；双螺旋区段上； （3）被切除的核苷酸既可是脱氧的也可是非脱氧的。）被切除的核苷酸既可是脱氧的也可是非脱氧的。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 3、35外切酶活性外切酶活性 TCGATAGCC AGCTAT E.coli DNApolI Mg 2+TCGATA AGCTAT + pC，pG，pC 5 4、核酸内切酶活性、核酸内切酶活性 当一段当一段DNA带有带有5游离端磷酸基团的不配对单链时，该酶游离端磷酸基团的不配对单链时，该酶 可以作用在此单链相

59、连的两对配对碱基之间，切断其磷酸二酯可以作用在此单链相连的两对配对碱基之间，切断其磷酸二酯 键。键。 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 5 5 3 3 EcoR 5 5 3 3 35 35 35 35 3 5 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 图图 DNA聚合酶聚合酶的切口平移的切口平移 基基 因因 工工 程程 GENE ENGINEERING 基因工程第二章DNA重组克隆操作 二、二、KlenowKlenow片段片段 DNA聚合酶聚合酶I 大片段大片段 小片段小片段 53聚合酶活性聚合酶活性 35外切酶活

60、性外切酶活性 53外切酶活性外切酶活性 蛋白酶蛋白酶 在分子克隆中的用途：在分子克隆中的用途： （1）补平经限制性内切酶消化）补平经限制性内切酶消化DNA所形成的所形成的3凹陷末端，包凹陷末端，包 括带裂口的双链括带裂口的双链DNADNA的修复。的修复。 （2 2） 对带对带3凹陷末端凹陷末端DNADNA分子进行末端标记。分子进行末端标记。 （3 3）在）在cDNAcDNA的克隆中用于合成的克隆中用于合成cDNAcDNA第二条链。第二条链。 （4 4）用于）用于SangerSanger双脱氧链终止法进行双脱氧链终止法进行DNADNA的序列分析。的序列分析。 基基 因因 工工 程程 GENE E