肺炎球菌免疫血清库的建立及应用（精品课件）

1、1 / 26 肺炎球菌免疫血清库的建立肺炎球菌免疫血清库的建立 及应用及应用 刘倩，张丽芝，张新庄，任克明，陈晓航，王剑虹，张钦， 沈荣 兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室 甘肃省疫苗 工程技术研究中心，甘肃 兰州 730046 摘要：目的摘要：目的 建立 24 个血清型的肺炎链球菌（简称肺炎球 菌）免疫血清库，为肺炎球菌疫苗中各型多糖含量准确测定 提供可靠保障。方法方法 制备肺炎球菌各型免疫血清：用肺 炎球菌菌株制备免疫原，按免疫程序接种青紫蓝兔，将符合 规定的免疫血清合并、除菌、分装后建档。鉴定肺炎球菌 各型免疫血清：全程采用速率散射比浊法进行鉴定。首先确 定肺炎球菌免疫血清工作浓度

2、，再通过特异性和线性对免疫 血清进行初步筛查（将筛出有交叉反应的免疫血清进行吸收） ，然后用血清交叉试验进行再次筛查，最后通过绘制反应曲 线（截取多糖质量浓度 1.0 5.0 g/mL 的线段）对免疫 血清进行线性评定。肺炎球菌免疫血清库的应用：用建成 的肺炎球菌免疫血清库中各型免疫血清和丹麦国家血清研究 所的诊断血清，检测 5 个厂家的 23 价肺炎球菌多糖疫苗的 各型多糖含量，对比结果。结果结果 建成的肺炎球菌免疫血 清库各型免疫血清效价较高；初步筛出的有交叉反应的免疫 血清，经吸收后交叉反应消失且线性良好（R20.98）；通 2 / 26 过血清交叉试验再次筛查，未见有交叉反应的免疫血清

3、；反 应曲线线段（多糖质量浓度 1.0 5.0 g/mL）线性良好 （R20.98）；应用两套血清检测 23 价肺炎球菌多糖疫苗的 多糖含量，差异无统计学意义（P 0.05）。结论结论 成功建 立了肺炎球菌免疫血清库，且各型免疫血清稳定、无交叉反 应，可用于肺炎球菌疫苗及其疫苗血清型多糖的各项免疫学 检测。. 关键词关键词: : 肺炎球菌免疫血清；血清型；多糖；血清库；速率 散射比浊法 中图分类号中图分类号: : R378 文献标志码文献标志码: : A 文章编号：文章编号： DOI:DOI:. SetSet upup a a pneumococcalpneumococcal antisera

4、antisera bankbank andand relatedrelated applicationapplication. LIU Qian, ZHANG Li-zhi, ZHANG Xin-zhuang, REN Ke- ming, CHEN Xiao-hang, WANG Jian-hong，. ZHANG Qin, SHEN rong First Department of Research, Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., . Center for Gansu Provincial Vaccine Engine

5、ering Research, Lanzhou 730046, Gansu Province, China. Corresponding author: SHEN rong, E-mail: guarantee Abstract:ObjectiveAbstract:Objective A pneumococcal antisera bank contained 24 serotypes of antiserums was set up, in order to provide a reliable guarantee in accurate 3 / 26 determination of re

6、lated polysaccharides contents in streptococcus pneumoniae vaccine. MethodsMethods All types of pneumococcal antiserums were prepared by using each serotype of pneumococcal strains as immunogen, respectively, the Chinchilla rabbits were immunized according to immunization schedule. The antiserums we

7、re mixed, filter-sterilized, aliquoted certified, then filing. The identification was carried out by rate nephelometry. First, the working concentration of pneumococcal antisera was determined. Secondly preliminary screening of antiserums were performed in both tests for specificity and linearity (t

8、he screened antiserums with cross-reaction were absorbed). Thirdly, all antiserums were performed by orthogonal test. Finally, each type of antiserum was evaluated linearity by plotting the reaction curve (intercept the line segment of 1.0 - 5.0 g/mL of polysaccharide mass concentration). Applicatio

9、n: twenty-three valent pneumococcal polysaccharide vaccine from 5 manufacturers were tested by the pneumococcal antisera banks, which included the set bank and the bank containing diagnostic serums form Statens serum institut, and the results were 4 / 26 compared. ResultsResults The each type serum

10、contained in pneumococcal antisera bank has a higher titer, and the cross-reaction was removed and showed a good linearity after absorption (R20.98). There was no cross-reaction in all antiserums screened by orthogonal test. The response curve segment (the line segment of 1.0 -5.0 g/mL of polysaccha

11、ride mass concentration) showed a good linearity (R20.98), by using the two banks to detect the polysaccharide content in the vaccine, and tested difference had no a statistical meaning (P0.05). ConclusionConclusion The pneumococcal antisera bank was successfully prepared, and all of contained antis

12、erums were stable and no cross-reaction, it can be used in immunological detection of pneumococcal vaccine and related types of polysaccharides . . KeyKey words:words: Pneumococcal antisera; Serotype; Pneumococcal vaccine; Sera bank; Rate nephelometry. _ 基金项目：基金项目：国家高技术研究发展计划项目（2012AA02A401） 作者简介：作者

13、简介：刘倩（1984-）,女, 助理研究员, 主要从事细菌性多 糖疫苗的研发工作。 通信作者：通信作者：沈荣,研究员, E-mail: 肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia）简称肺炎球菌，是 引起儿童和老年人获得性感染的主要病原菌，其感染所致疾病主 5 / 26 要包括肺炎、菌血症、脑膜炎、中耳炎等1。疫苗接种是预防肺 炎球菌感染最有效的方. 法，目前上市的肺炎球菌疫苗主要有23价肺炎球菌多糖疫苗和13 价肺炎球菌结合疫苗两类。根据欧洲药典规定，23价肺炎球 菌多糖疫苗及13肺炎球菌结合疫苗均需采用免疫学的方法对各型 肺炎球菌荚膜多糖（pneumococcal capsu

14、lar polysaccharide，PnPS）含量进行测定，且所用的各型肺炎球菌 免疫血清均须为特异性血清2。PnPS是肺炎球菌疫苗的主要免疫 原性成分，其含量的测定是肺炎球菌疫苗一项重要质量控制指标。 因此，建立稳定、无交叉反应的肺炎球菌免疫血清库是控制肺炎 球菌疫苗质量的关键因素。本研究拟. 建立包含1、2、3、4、5、6A、 6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A 、19F、20、22、23F、33F在内的24个疫苗血清型的肺炎球菌免疫 血清库，并对其进行鉴定，用于PnPS含量的测定，为控制肺炎球 菌疫苗质量提供保障。现将结果报告如下。

15、. 1 1 材料与方法材料与方法 1.11.1 菌株 肺炎球菌菌株 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F、33F 型均由中国医学 细菌保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）提供。. 1.21.2 多糖及诊断血清 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 6 / 26 15B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F 和 33F 型 P

16、nPS 均由兰 州生物制品研究所有限责任公司（简称兰州多糖）提供和购自美 国菌种保藏中心（简称 ATCC 多糖），其中兰州多糖各项质量检定 结果均符合欧洲药典中 23 价肺炎球菌多糖疫苗制造和检定规 程的相关要求2 ，1H-NMR 核磁检定结果与默克公司公布的结果一 致；对应的肺炎球菌诊断血清均购自丹麦国家血清研究所 （Statens serum institut，SSI），简称 SSI 血清。. 1.31.3 疫苗 23 价肺炎球菌多糖疫苗分别由厂家 1、厂家 2、厂 家 3、厂家 4 和厂家 5 提供（厂家 1、厂家 2 和厂家 3 的疫苗为未 上市疫苗；厂家 3 和厂家 4 的疫苗为已上

17、市疫苗）。. 1.41.4 实验动物 SPF 级青紫蓝兔，体重约 2.5kg，由兰州生 物制品研究所有限责任公司实验动物室提供。. 1.51.5 主要试剂及仪器 8%羊血哥伦比亚琼脂平板培养基（固体 培养基）购自甘肃荣昌生化制剂厂；胰蛋白酶大豆肉汤培养基 （tryptic soy broth, TSB）购自德国 Merck KGaA；液体培养基 由兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室制备4。 APPLIKON BIO 30L 发酵罐购自荷兰 APPLIKON 公司；特定蛋白分 析仪 IMMAGE 800、UDR 试剂盒、反应杯及配套的缓冲液、洗液均 购自美国贝克曼库尔特公司。. 1.61.

18、6 肺炎球菌各型免疫血清库的建立 1.6.11.6.1 免疫原的制备 将肺炎球菌菌株 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22、23F、33F 型作为菌株分别 传种于固体培养基上，然后刮取菌苔经液体培养基传种于发酵罐 7 / 26 继续培养，将发酵罐收获的各型菌液用热灭活方式处理后，经 4 200 r/min 离心半径（10.82cm）30 min，弃上清，收集菌体。生 理盐水洗涤菌体两次，用比浊法将菌体浓度稀释至 80 亿/mL 后分 装备用。. 1.6.21.6.2 免疫血清的制备 将制备好的免

19、疫原（各型肺炎球菌） 经兔耳缘静脉注射，基础免疫 4 周（免疫 8 次），加强免疫 2 周 （免疫 4 次），免疫程序见表 1。完成免疫程序后 58 d 经耳缘 静脉采血，10 000 r/min 离心半径（6.6cm）10 min 收集上清， 用生理盐水稀释 4 倍后，以特定蛋白分析仪检测效价。当上清的 反应浊度值400 时，结 束免疫，颈动脉采全血。待血清过夜析出后，经 4 200 r/min 离 心半径（10.82cm）30 min，收集上清，加入 0.01%硫柳汞溶液。 将上述获得的肺炎球菌各型免疫血清分别合并，经 0.2 m 滤膜 过滤、分装后，保存于-70 冰箱。. 表表 1 1

20、免疫程序 Tab.1Tab.1 Rabbit immunization schedule 免疫类型 免疫时间 (周) 免疫剂量 （mL） 免疫次数 （次） 第 1 周0.2 2 第 2 周0.4 2 第 3 周0.7 2 基础免疫 第 4 周1.0 2 第 5 周1.5 2 加强免疫 第 6 周1.5 2 注注：每周注射时间为每周一和周五各注射 1 剂。 1.6.31.6.3 免疫血清的建档 对免疫血清进行建档，填写各项免 疫血清信息（血清批号、采血日期、分装日期、血清总量、分装 管数、血清效价）及最终鉴定结果。将鉴定后的肺炎球菌各型混 合免疫血清命名为兰州肺炎球菌免疫血清库（简称 Lanzh

21、ou 血清 库）。. 8 / 26 1.71.7 免疫血清的鉴定 采用速率散射比浊法5，确定肺炎球 菌各型免疫血清的工作浓度，并通过特异性和线性对免疫血清进 行初步筛查，用血清交叉试验进行再次筛查，最后通过绘制反应 曲线（截取多糖质量浓度 1.0 5.0 g/mL 的线段）对免疫血清 进行线性评价。. 1.7.11.7.1 溶液配制 PnPS 参考品 1：24 个血清型的 PnPS（兰 州多糖）用生理盐水配制的终浓度为 50.0 g/mL 的 24 价混合溶 液；PnPS 参考品 2：24 个血清型的 PnPS（ATCC 多糖）用生理 盐水配制的终浓度为 50.0 g/mL 的 24 价混合溶

22、液；空白对照： 0.86%的生理盐水溶液；阳性对照：PnPS 参考品 1 用生理盐水 稀释为质量浓度 5.0 g/mL 的 24 价混合溶液；阴性对照：依 照文献5制备不含本型 PnPS 的阳性对照（如 1 型的阴性对照为 不含 1 型 PnPS 的阳性对照）；1.0 5.0 g/mL PnPS 参考品： 将 PnPS 参考品 1 系列稀释成质量浓度为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/mL 的 24 价混合溶液，分别记为 1.0 g/mL- PnPS 参考品、2.0 g/mL- PnPS 参考品等；PnPS 单价原液：24 个血清型的 PnPS（兰州多糖）分别用生理盐水配制 的终浓

23、度为 5.0 mg/mL 的单价原液；PnPS 单价溶液：将 24 个 血清型的 PnPS 单价原液稀释为质量浓度 5.0 g/mL 的单价溶液； 样品：23 价肺炎球菌多糖疫苗用生理盐水稀释 20 倍备用（质 量浓度为 2.5 g/mL）。. 1.7.21.7.2 参数设置 特定蛋白分析仪采用非竞争性速率模式， 参考品或样品 20 L，免疫血清 20 L，缓冲液 200 L，信号 放大系数（Gain）4，反应时间 2.5 min，每份血清重复检测 2 次。 9 / 26 . 1.7.31.7.3 免疫血清的工作浓度的确定 标准曲线绘制：将 1.0 5.0 g/mL PnPS 参考品与工作浓度

24、的免疫血清先后放入仪器， 在 1.7.2 项设定的参数条件下进行检测；定标结束后产生仪器响 应（instrumental response, IR），IR 值与参考品设定点浓度 进行一阶多项式曲线拟合，仪器自动生成标准曲线y=A+Bx，并显 示线性回归方程和决定系数（R2）6-8。样品检测：将备用的样 品放入仪器进行检测，检测结束后仪器会根据之前生成的标准曲 线计算并打印结果。工作浓度的确定：将待测免疫血清用生理 盐水稀释 8 倍（基础稀释倍数），根据仪器显示的决定系数 （R2）不断上调待测免疫血清的稀释倍数，至R20.98 且标准曲线 最低质量浓度（1.0 g/mL- PnPS 参考品）与空

25、白对照的 IR 值差 异有统计学意义（P0.98；标 准曲线最低质量浓度（1.0 g/mL- PnPS 参考品）与空白对照的 IR 值/均值的差异有统计学意义（P0.05），见表 2。. 表表 2 2 免疫血清的工作浓度 Tab.2Tab.2 Working concentration of antisera 血清型 稀释倍数 （倍） 决定系数 （R2） 空白对照 均值 1.0 g/mL- PnPS 参 考品均值 a 1480.99432.1477.84 2320.99551.4759.35 3320.99600.24105.71 4320.99781.1554.63 5240.99133.4

26、942.27 6A200.99541.9022.65 6B480.99941.9034.39 7F480.99911.1554.50 8320.99862.0789.81 9N480.99954.4461.49 9V320.99981.5518.22 10A200.99875.2073.58 11A320.99460.3660.23 12F320.99023.0451.92 14160.99581.8681.34 15B240.99312.0536.39 17F240.99811.8435.25 18C480.99423.9084.65 19A480.99511.1059.15 19F320.

27、99503.0346.92 20320.99871.7455.93 22F200.99941.64 193.05 23F200.99740.4538.06 33F320.99621.7534.80 注注：a 表示与空白对照相比，P0.05），表明通过特异性检验，初步筛查出 6A、6B、19A 和 19F 型免疫血清为有交叉反应的免疫血清，见表 3。. 12 / 26 表表 3 3 各型免疫 血清的特异性 Tab.3Tab.3 Specificity of antisera 注注：a 表示与空白对照相比，P0.05）；但免疫血清的工作浓度也相应降低，见表 4。. 表表 4 4 免疫血清吸收前后对

28、比 Tab.4Tab.4 Comparison of antisera before and after absorption. 吸收前吸收后 血清 型 工作 浓度 （倍） 空白 对照 均值 阴性 对照 均值 阳性 对照 均值 工作 浓度 （倍） 空白对 照 均值 阴性对 照 均值 a 阳性 对照 均值 6A20 5.47 265.6 2 366.6 4 41.183.40 229.2 6 血清 型 空白对照均值阴性对照均值阳性对照均值 1 1.60 3.43 402.27 2 3.74 9.76 543.52 3 2.14 2.78 583.16 4 3.22 5.50 330.00 5 4

29、.54 3.31 216.98 6A 5.47 265.62a 366.64 6B 20. 47 438.76a 590.05 7F 2.24 1 .00 338.88 8 7.61 3 .89 536.07 9N 2.26 2 .81 379.99 9V 7.08 6.00 161.17 10A 3.22 1.12 458.07 11A 1.23 2.24 233.55 12F 2.13 1.72 304.70 14 3.87 8.15 468.60 15B 3.65 2.02 267.68 17F 1.58 6.63 230.26 18C 1.92 2.77 600.00 19A 4.85

30、 56 5.20a 714.76 19F 7.55 275.62a 471.90 20 1.21 3.44 284.75 22F 0.00 0.00 1104 .20 23F 1.93 1.10 242.58 33F 1.08 0.62 307.53 13 / 26 6B4820.47 438.7 6 590.0 5 161.473.44 254.6 4 19A48 4.85 565.2 0 714.7 6 161.482.85 497.1 6 19F32 7.55 275.6 2 471.9 0 161.560.00 303.6 0 注注：a 表示与空白对照相比，P0.05（采用秩和检验，

31、Z=1.095，P=0.273） 。 吸收前后免疫血清的线性回归分析结果显示，在设定条件下， 1.0 5.0 g/mL PnPS 参考品与相应 IR 值呈良好的线性关系， R20.98，见图 1。. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 123456 IR值 多糖浓度（g/mL） 1a 6A 6B 19A 19F 线性 (6A) 线性 (6B) 线性 (19A) 线性 (19F) 0 100 200 300 400 500 600 123456 IR值 多糖浓度（g/mL） 1b 6A 6B 19A 19F 线性 (6A) 线性 (6B) 线性 (19A) 线性

32、(19F) 注注: : 1a 表示吸收前，4 条标准曲线所对应方程及R2值： 6A 型：y = 77.582x - 29.516，R = 0.9934；6B 型：y = 105.88x - 67.393，R = 0.9969；19A 型：y = 157.59x - 86.91，R = 0.9974；19F 型：y = 127.26x - 44.093；R = 0.9988。. 1b 表示吸收后，4 条标准曲线所对应方程及R2值： 6A 型：y = 51.10 x - 26.652，R = 0.9954；6B 型：y = 54.889x - 10.447，R = 0.9978；19A 型：y =

33、 109.39x - 65.479，R = 0.9973；19F 型：y = 70.598x - 43.272；R = 0.9983。. 图图 1 1 吸收前后免疫血清的线性回归分析 Fig.1Fig.1 Linear regression analysis of antisera before and after absorption . 2.1.42.1.4 血清交叉试验 结果显示，所有免疫血清（包括无交 叉反应血清和吸收血清）与本型 PnPS 单价溶液反应值较高（IR 值 14 / 26 160）；和非本型 PnPS 单价溶液反应值较低（IR 值0.05），见表 5。表明通过血清交叉试验

34、的最终鉴定，未发现有交叉反应的免疫 血 清。. 表表 5 5 免疫血清的血清交叉试验 Tab.5Tab.5 Orthogonal test of antisera PnPS 单价溶液（5.0 g/mL） 血 清 型 1 2 3 4 56A6B7F 89N9V 10 A 11 A 12 F 14 15 B 17 F 18 C 19 A 19 F 20 22 F 23 F 33 F 空 白 a 1 41 2. 4 3. 1 6. 7 4. 5 2. 4 2. 1 1. 5 2. 1 4. 7 2. 2 1. 7 2. 0 1. 1 2. 1 1. 8 1. 8 1. 8 1. 0 1. 9 2.

35、5 2. 0 1. 8 0. 9 1. 8 2. 1 2 0. 0 52 3. 9 0. 7 2. 1 1. 3 1. 2 1. 2 1. 0 0. 8 0. 2 1. 1 1. 1 1. 5 1. 2 0. 0 2. 1 2. 5 2. 1 2. 8 1. 9 6. 9 1. 5 1. 6 1. 5 1. 5 3 0. 0 0. 2 56 0. 3 0. 0 4. 8 3. 9 0. 4 2. 1 0. 4 0. 4 0. 2 0. 4 0. 1 0. 5 0. 4 0. 6 0. 0 0. 1 0. 2 2. 5 9. 8 1. 2 0. 8 1. 3 0. 2 4 2. 3 1. 5 1

36、. 6 33 0. 0 0. 8 0. 6 0. 4 0. 6 2. 1 2. 3 0. 9 0. 9 0. 9 0. 1 0. 2 0. 4 0. 7 0. 2 0. 2 0. 3 0. 3 0. 6 0. 9 0. 5 1. 2 5 3. 0 1. 4 5. 5 2. 8 21 6. 9 2. 7 1. 6 5. 4 3. 2 3. 5 1. 1 1. 1 1. 3 2. 6 2. 7 1. 4 1. 7 1. 0 3. 5 0. 8 1. 9 0. 3 2. 3 2. 4 3. 5 6A 2.1.3.1.1.292.2.2.1.1.1.1.1.1.1.2.2.2.0.2.1.1.1. 3

37、. 15 / 26 0 4 3 5 25. 8 1 1 0 7 9 5 1 8 5 7 0 1 2 1 1 1 0 31 6B 4. 2 0. 3 0. 6 0. 4 1. 5 3. 9 29 5. 0 2. 5 2. 2 2. 4 1. 5 0. 2 0. 5 5. 1 2. 8 3. 1 2. 2 2. 3 0. 6 2. 5 9. 8 1. 2 0. 8 1. 3 1. 2 7F 1. 1 2. 3 10 .3 1. 7 2. 4 1. 6 2. 5 33 8. 0 2. 6 2. 2 3. 5 1. 8 3. 6 3. 9 3. 4 4. 0 2. 9 1. 3 2. 2 1. 4 1

38、. 7 1. 9 2. 2 4. 6 2. 1 8 2. 5 3. 0 9. 4 1. 9 1. 4 1. 9 2. 3 0. 8 53 6. 0 1. 3 1. 7 2. 2 2. 5 1. 9 1. 4 1. 9 1. 9 2. 4 1. 3 0. 7 2. 9 1. 1 2. 9 0. 5 4. 4 9N 1. 6 1. 5 1. 4 1. 3 1. 5 2. 4 2. 0 2. 3 1. 0 37 9. 0 2. 1 1. 5 2. 7 10 .7 1. 9 1. 4 1. 4 1. 2 2. 5 1. 5 1. 9 2. 5 3. 8 0. 3 1. 6 9V 4. 3 2. 7 3

39、. 7 1. 6 3. 2 2. 0 1. 1 4. 8 2. 8 3. 4 16 1. 0 2. 6 3. 1 2. 5 3. 4 3. 0 2. 7 2. 6 2. 8 3. 0 2. 3 1. 4 5. 4 3. 1 5. 2 10 A 2. 2 2. 5 1. 3 1. 5 1. 2 0. 6 1. 8 1. 2 1. 7 1. 0 0. 2 45 8. 0 0. 7 0. 8 0. 4 0. 3 0. 2 0. 5 0. 2 0. 1 0. 2 0. 7 0. 1 0. 4 0. 4 11 A 2. 3 3. 1 2. 6 2. 8 4. 9 3. 3 2. 7 4. 8 3. 1

40、3. 2 2. 0 4. 0 23 3. 0 2. 4 2. 0 2. 3 3. 6 3. 8 3. 8 3. 0 2. 1 3. 2 3. 6 3. 0 3. 0 12 F 2. 1 4. 0 7. 6 3. 9 4. 0 1. 5 3. 2 4. 6 2. 7 3. 5 4. 0 3. 9 1. 4 30 4. 4. 1 4. 7 3. 9 2. 0 9. 2 2. 6 3. 0 1. 1 2. 5 2. 4 1. 9 16 / 26 0 14 2. 3 4. 0 3. 0 3. 5 1. 8 5. 3 2. 1 5. 1 2. 0 2. 0 3. 2 1. 4 2. 0 0. 9 46

41、8. 0 1. 7 2. 8 4. 1 1. 8 5. 7 3. 3 2. 9 2. 4 4. 8 2. 1 15 B 4. 3 2. 6 2. 2 3. 0 1. 8 1. 5 0. 9 3. 5 5. 8 1. 1 3. 1 4. 6 5. 2 7. 1 1. 6 26 7. 0 1. 9 2. 1 2. 1 6. 3 1. 7 1. 4 1. 6 2. 4 1. 8 17 F 3. 7 2. 0 4. 6 0. 8 1. 2 1. 5 3. 8 6. 5 3. 1 1. 7 1. 1 1. 5 2. 4 4. 2 6. 0 5. 7 23 0. 0 1. 8 3. 1 3. 4 2. 5

42、 3. 9 2. 0 2. 8 3. 9 18 C 0. 0 3. 7 2. 3 2. 2 0. 3 1. 2 1. 2 3. 2 0. 9 2. 2 0. 7 0. 5 0. 7 0. 6 1. 7 1. 1 2. 9 60 0. 0 0. 7 0. 6 0. 3 2. 5 1. 9 0. 0 1. 1 19 A 2. 8 2. 3 3. 2 3. 0 3. 3 2. 2 2. 2 2. 3 1. 5 2. 8 2. 4 0. 6 3. 1 3. 2 2. 7 2. 3 6. 8 1. 9 35 7. 8 2. 3 2. 9 3. 7 2. 9 1. 9 3. 0 19 F 0. 7 1.

43、9 7. 8 2. 1 2. 4 4. 0 4. 4 2. 2 2. 5 2. 9 3. 2 2. 6 2. 2 2. 0 3. 4 11 .8 2. 9 2. 9 3. 8 45 9. 0 1. 9 1. 4 1. 8 1. 6 1. 7 20 4. 9 7. 5 2. 9 4. 6 2. 3 2. 9 2. 4 0. 7 2. 2 1. 7 2. 0 2. 1 1. 5 3. 9 2. 0 3. 3 1. 4 2. 1 0. 7 3. 5 28 4. 0 2. 4 2. 5 4. 9 1. 6 22 F 5. 5 2. 2 1. 2 2. 0 1. 3 0. 0 0. 5 3. 0 2.

44、3 5. 7 0. 8 3. 5 0. 6 2. 0 1. 2 0. 3 1. 0 2. 2 0. 6 0. 7 1. 1 39 3. 0 1. 2 9. 7 0. 5 17 / 26 23 F 3. 9 1. 5 3. 6 3. 2 2. 8 1. 6 3. 5 3. 2 2. 5 2. 0 2. 9 2. 1 2. 9 2. 1 2. 4 4. 0 4. 1 4. 9 1. 8 5. 0 1. 2 3. 3 24 2. 0 3. 3 1. 8 33 F 2. 8 5. 9 4. 4 4. 8 4. 3 3. 8 4. 5 3. 4 2. 9 4. 6 3. 2 3. 0 3. 1 1. 8

45、 3. 2 3. 4 2. 2 2. 7 4. 4 2. 7 5. 2 2. 5 2. 7 30 7. 0 2. 5 注注：a 表示空白对照 IR 值与非本型 PnPS 单价溶液 IR 值相比， P0.05（采用Dunnett T3检验）。. 2.1.52.1.5 免疫血清反应曲线 免疫血清分别与 PnPS 参考品 1 和 PnPS 参考品 2 的反应曲线，其中图 2a 和 2b 分别为兰州多糖和 ATCC 多糖 3、4、5、8、9N、11A、17F、18C 型的反应曲线，该组 血清型的最高反应点均低于 10.0 g/mL；图 2c 和 2d 分别为兰 州多糖和 ATCC 多糖 6B、9V、1

46、2F、14、15B、20、22F 和 23F 型的 反应曲线，该组血清型的最高反应点均为 10.0g/mL；图 2e 和 2f 分别为兰州多糖和 ATCC 多糖 1、2、6A、7F、10A、19A、19F、33F 型的反应曲线，该组血清型 的最高反应点均高于 10.0 g/mL。见图 2。. 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 10 20 30 40 50 60 IR值 多糖浓度 (g/mL) 2a 3型 4型 5型 8型 9N型 11A型 17F型 18C型 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 10 20 30

47、40 50 60 IR值 多糖浓度 (g/mL) 2b 3型 4型 5型 8型 9N型 11A型 17F型 18C型 18 / 26 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 50 60 IR值 多糖浓度 (g/mL) 2c 6B型 9V型 12F型 14型 15B型 20型 22F型 23F型 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 50 60 IR值 多糖浓度 (g/mL) 2d 6B型 9V型 12F型 14型 15B型 20型 22F型 23F型 1,000 2,000 3,000 4,000 5,0

48、00 6,000 7,000 0 10 20 30 40 50 60 IR值 多糖浓度 (g/mL) 2e 1型 2型 6A型 7F型 10A型 19A型 19F型 33F型 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 0 10 20 30 40 50 60 IR值 多糖浓度 (g/mL) 2f 1型 2型 6A型 7F型 10A型 19A型 19F型 33F型 注注：2a、2c、2e 为兰州多糖；2b、2d、2f 为 ATCC 多糖。 图图 2 2 免疫血清的反应曲线 Fig.2Fig.2 Reaction curves of antisera 在免疫血清的反应曲

49、线（图 2a、2c、2e）中，取多糖质量浓 度 1.0 5.0 g/mL 的线段作线性回归分析。结果可见，各型免 疫血清在多糖质量浓度 1.0 5.0 g/mL 时线性良好， R20.98，且标准曲线最低浓度（1.0 g/mL- PnPS 参考品）与空 白对照的 IR 值差异有统计学意义（P0.05（采用秩和检验， Z=4.197，P=0.000）。 2.22.2 肺炎球菌免疫血清库的应用 结果显示，用Lanzhou 血清 库和 SSI 血清分别检测来自5 个厂家的 23 价肺炎球菌多糖疫苗的各 型多糖含量，两种不同来源血清检测结果的差异无统计学意义 （P0.05），CV值0.05（采用配对t

50、检验，t值 分别为 0.725、0.524、2.38、0.241、0.695；P值分别为 0.476、0.606、0.126、0.812、0.495）。. 3 3 讨讨 论论 PnPS 是肺炎球菌疫苗的主要免疫原性成分，PnPS 含量的测定 是肺炎球菌疫苗一项重要质量控制指标。肺炎球菌疫苗中各型 PnPS 免疫原性的分析完全依赖于特异性肺炎球菌免疫血清，稳定、 无交叉反应的肺炎球菌免疫血清库是控制肺炎球菌疫苗质量的关 键因素。. 速率散射比浊法是一种抗原-抗体结合反应的动态测定法，其 快速灵敏，优于传统的免疫学检测方法（如免疫双扩散，凝集试 验等）；不受带电抗原的限制，在中性多糖（如 7F、1

51、4、22F、33F 型 PnPS）检测方面优于火箭电泳法10-11。本 研究全程采用速率散射比浊法用于肺炎球菌免疫血清库的建立和 鉴定。用速率散射比浊法确定肺炎球菌各型免疫血清的工作浓度， 19F 29. 90 25. 90 10. 16 26. 70 26. 00 2.0 1 27. 10 25. 10 5.5 6 34. 50 31. 50 6.3 3 24. 40 22. 00 7.3 1 20 14. 00 17. 20 14. 5 17. 70 21. 40 13. 38 22. 60 25. 40 8.2 5 22. 00 23. 50 4.6 6 22. 40 24. 00 4.

52、8 8 22F 28. 80 30. 90 4.9 7 28. 50 28. 40 0.2 5 25. 30 27. 20 5.2 6 30. 50 33. 10 5.7 8 23. 50 23. 30 0.6 0 23F 23. 50 25. 10 4.6 6 32. 10 38. 10 12. 13 24. 10 27. 90 10. 27 25. 30 29. 40 10. 66 22. 30 25. 50 9.5 6 33F 22. 10 21. 60 1.5 4 29. 20 30. 00 1.9 1 26. 80 26. 80 0.0 7 27. 00 26. 50 1.1 2 2

53、0. 20 20. 20 0.0 0 23 / 26 结果显示在此工作浓度下，标准曲线线性良好，R20.98；且标准 曲线最低浓度（1.0 g/mL- PnPS 参考品）与空白对照的差异有 统计学意义（P0.05）， 符合中国食品药品检定研究院对肺炎球菌各型免疫血清的考核标 24 / 26 准，即“非特异反应的 IR 值均低于特异性反应的 10%，低于空白 对照的 23 倍，最低稀释度的浊度值均高于空白对照的 23 倍” 。血清交叉试验证明，用速率散射浊度法检测混合溶液中的目标 多糖含量时，肺炎球菌各型免疫血清中所含其他非特异性物质不 会对试验结果造成影响。. 为全面考察肺炎球菌各型免疫血清的反应性，使用 Lanzhou 多糖和 ATCC 多糖绘制反应曲线。结果证明，无论使用何种来源的 多糖，免疫血清的反应趋势基本一致。这不仅说明各型免疫血清 的反应性比较稳定，还表明 lanzhou 多糖和 ATCC 多糖的抗原性基 本一致。多数多糖在质量浓度为 0.3 50.0 g/mL 时与对应血 清的反应强度呈正相关（越过反应最高点，