分子生物学(1)

1、编辑ppt1 编辑ppt2 分子生物学是从分子生物学是从分子水平分子水平研究生命现象、生命规律和生命本质研究生命现象、生命规律和生命本质 的学科。的学科。 核心内容是从分子水平研究核心内容是从分子水平研究基因和基因的活动基因和基因的活动，这些活动主要，这些活动主要 通过核酸和蛋白质的活动来实现。通过核酸和蛋白质的活动来实现。 医学分子生物学医学分子生物学主要研究人体主要研究人体生物大分子生物大分子和大分子体系的结构、和大分子体系的结构、 功能、相互作用及其与功能、相互作用及其与疾病疾病发生、发展的关系。发生、发展的关系。 What is Molecular Biology? 编辑ppt3 一、

2、分子生物学的孕育阶段：一、分子生物学的孕育阶段：1928195219281952 二、分子生物学的创立阶段：二、分子生物学的创立阶段：1953196519531965 三、分子生物学的发展阶段：三、分子生物学的发展阶段：19661966现在现在 Molecular biology( (分子生物学分子生物学) ) 核酸的发现和功能的初步研究核酸的发现和功能的初步研究 双螺旋结构模型双螺旋结构模型操纵子学说操纵子学说 DNADNA重组技术重组技术 编辑ppt4 19701970年，年，Temin Temin 和和BaltimoreBaltimore发现逆转录酶。发现逆转录酶。 19721972年年

3、 StanfordStanford大学大学P. Berg P. Berg 构建第一个重组构建第一个重组DNADNA分子分子( (猿猴病毒猿猴病毒DNADNA和和噬菌体噬菌体DNA)DNA) Arber,Smith,NathansArber,Smith,Nathans发现限制性内切酶发现限制性内切酶, ,获获19781978年诺贝尔生理学和医学奖。年诺贝尔生理学和医学奖。 19771977年年 旧金山建立世界上第一家遗传公司，专门应用重组旧金山建立世界上第一家遗传公司，专门应用重组DNADNA技术制造医学药物。技术制造医学药物。 19801980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组

4、DNADNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂 Sanger Sanger 测定核酸序列，测定核酸序列，19801980年与伯格年与伯格(Berg)(Berg)（重组（重组DNADNA技术）分享技术）分享Nobel Nobel 生理医学奖。生理医学奖。 19851985年由年由Mullis Mullis 创立创立PCRPCR技术，因此获得了技术，因此获得了19931993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 19891989年年AltmanAltman、 CechCech发现核酶共享发现核酶共享NobelNobel化学奖化学奖. . 19901990年年 荷兰科学家荷兰科学家 培育世界第一头

5、转基因牛培育世界第一头转基因牛 用牛奶生产乳铁蛋白用牛奶生产乳铁蛋白 19911991年年 英国罗林研究所和英国罗林研究所和PPLPPL公司培育转基因羊公司培育转基因羊 用羊奶生产抗胰蛋白酶用羊奶生产抗胰蛋白酶 转基因动物、转基因植物转基因动物、转基因植物 1990 1990 启动人类基因组计划启动人类基因组计划 19931993年年Roberts & SharpRoberts & Sharp发现发现Splitting geneSplitting gene 20002000年人类基因组草图测序完成；果蝇、线虫及其他年人类基因组草图测序完成；果蝇、线虫及其他 功能基因组学功能基因组学 基因治疗技

6、术基因治疗技术 发展阶段发展阶段 编辑ppt5 Base on but exceed the textbook(基于教材但高于教 材) Refer to the new technique,discovery and theory （阅读文献，跟踪最新进展） Experimental operation （实验设计和操作） 授课方式：按主题讲述授课方式：按主题讲述 编辑ppt6 Research : 1.the structure and the function of macromolecules. （大分子的结构与功能） 2.the regulation and control of ge

7、ne expression. （基因表达的调控） 3.the DNA recombination technique. （DNA重组技术） 4. the structure and the function of genome , Bioinformatics . (基因组结构和功能，生物信息学) 编辑ppt7 1.1.分子遗传学分子遗传学( ( 孙乃恩孙乃恩) ) 2.2.现代分子生物学（朱玉贤、李毅等现代分子生物学（朱玉贤、李毅等) ) 3.3.分子生物学分子生物学 (Instant Notes in Molecular Biology, 2nd Edition by P Turner）

8、4.4.分子生物学分子生物学( (闫隆飞闫隆飞) ) 5. Molecular Biology of the Cell (4th Edition by B Alberts) 6. Molecular Cell Biology (4th Edition by H Lodish) 7. Molecular Biology (2nd Edition by R Weaver) 8. Advanced Molecular Biology (by R Twyman) 编辑ppt8 1 . 1 . 分子克隆实验指南分子克隆实验指南 2. 2. 精编分子生物学实验指南精编分子生物学实验指南 3. 3. PCR

9、PCR技术实验指南技术实验指南 4. 4. 分子生物学实验基础分子生物学实验基础 5. 5. 细胞细胞生物生物学实验方案学实验方案 6. 6. 现代分子生物学实验技术现代分子生物学实验技术 7. 7. 分子生物学实验技术分子生物学实验技术 8.8. 分子生物学基础技术分子生物学基础技术 编辑ppt9 编辑ppt10 基因简史基因简史: : Mendal (1866): Mendal (1866): 遗传因子遗传因子 Sutten (1903): Sutten (1903): 染色体染色体 Johannson (1909): Johannson (1909): 基因、基因型、表型基因、基因型、表

10、型 Morgan (1910): Morgan (1910): 基因学说基因学说 Bendle and Tatum: Bendle and Tatum: 一个基因一个基因, ,一个酶一个酶 Avery (1944): Avery (1944): 证实基因是由证实基因是由DNADNA组成组成 Walson and Crick (1953): DNAWalson and Crick (1953): DNA的双股螺旋结构的双股螺旋结构 1960s: 1960s: 遗传密码遗传密码 1990s: 1990s: 基因序列测定基因序列测定 2000s: HGP2000s: HGP 编辑ppt11 分子生物

11、学分子生物学概念：是指贮存生物功能产物概念：是指贮存生物功能产物(RNA(RNA 和蛋白质和蛋白质) )序列信息以及表达这些信息所必需的序列信息以及表达这些信息所必需的 全部核苷酸序列，大多生物基因为全部核苷酸序列，大多生物基因为DNADNA，少数为，少数为 RNARNA。 编辑ppt12 组成组成 碱基：腺嘌呤碱基：腺嘌呤(A)(A)、鸟嘌呤、鸟嘌呤(G)(G)、 胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)(C) 脱氧核苷脱氧核苷( (碱基碱基+ +脱氧核糖脱氧核糖= =脱氧核苷脱氧核苷) ) 脱氧核苷酸脱氧核苷酸( (脱氧核苷脱氧核苷+ +磷酸磷酸) ) 33、55磷酸二酯键连接脱

12、氧核糖核苷酸形成磷酸二酯键连接脱氧核糖核苷酸形成 一条多核苷酸链一条多核苷酸链 编辑ppt13 编辑ppt14 编辑ppt15 三级结构即超螺旋结构三级结构即超螺旋结构(supercoil)(supercoil)。 核小体核小体(nucleosome)(nucleosome)：DNADNA双链盘绕组蛋白双链盘绕组蛋白(H2A, (H2A, H2B, H3, H4)H2B, H3, H4)核心的表面核心的表面, ,许多核小体连接成串许多核小体连接成串 珠状珠状, , 再反复盘旋折叠形成染色单体再反复盘旋折叠形成染色单体 (chromatid)(chromatid)。 编辑ppt16 多元酸多元酸

13、 紫外吸收：最大吸收峰在紫外吸收：最大吸收峰在260nm260nm处处 变性、复性与杂交变性、复性与杂交 编辑ppt17 n 基因的结构基因的结构 结构基因：结构基因：编码区序列（编码区序列（coding region sequencecoding region sequence ） 转录调控序列：转录调控序列：非编码序列（非编码序列（non-coding sequencenon-coding sequence） 基因表达需要的调控区（基因表达需要的调控区（regulatory regionregulatory region）序列，）序列， 包括启动子（包括启动子（promoterpromot

14、er）、增强子（）、增强子（enhancerenhancer）等。）等。 在细胞内表达为蛋白质或功能在细胞内表达为蛋白质或功能RNARNA的的DNADNA序列序列 三、基因的结构特点和分类三、基因的结构特点和分类 编辑ppt18 （一）、结构基因（一）、结构基因 1. 1. 概念概念 在细胞内表达为蛋白质或功能在细胞内表达为蛋白质或功能RNARNA的的DNADNA序列序列 2. 2. 结构基因结构特点结构基因结构特点 原核生物原核生物: : 连续连续 真核生物真核生物: : 断裂基因断裂基因, , 外显子外显子(exon)(exon)与内与内 含子含子(intron)(intron) 病毒：连

15、续或间断，取决于宿主。病毒：连续或间断，取决于宿主。 编辑ppt19 真核基因结构不连续，为断裂基因（真核基因结构不连续，为断裂基因（split genesplit gene）。）。 真核基因结构真核基因结构 外显子外显子（exonexon）；在基因序列中，出现在成熟）；在基因序列中，出现在成熟mRNAmRNA分子上分子上 的序列。的序列。 内含子内含子（intronintron）：外显子之间、与）：外显子之间、与mRNAmRNA剪接过程中被删剪接过程中被删 除部分相对应的间隔序列。除部分相对应的间隔序列。 编辑ppt20 （二）、转录调控序列（二）、转录调控序列 1 1 原核生物的转录调控序

16、列原核生物的转录调控序列 启动子：启动子：-35-35区（识别），区（识别）， -10-10区（结合）区（结合） 终止子：终止子： 操纵元件操纵元件 正调控蛋白结合位点正调控蛋白结合位点 编辑ppt21 2. 2. 真核生物的转录调控序列真核生物的转录调控序列( (顺式作用元件顺式作用元件) ) 启动子：转录因子启动子：转录因子(TF)(TF) 上游启动子元件：上游启动子元件：CAAT, CACACAAT, CACA及及GCGC盒盒 增强子：增强子： 反应元件：热休克反应元件反应元件：热休克反应元件, , 糖皮质激素反应糖皮质激素反应 元件元件 Poly(A)Poly(A)信号：信号： 编辑p

17、pt22 位于基因转录区前后，对基因表达起调控作用的区位于基因转录区前后，对基因表达起调控作用的区 域，因其是紧邻的域，因其是紧邻的DNADNA序列，又称旁侧序列。序列，又称旁侧序列。 转录调控序列转录调控序列（顺式作用元件）：（顺式作用元件）： 编辑ppt23 真核生物有真核生物有3 3类启动子，分别对应于细胞内存在的类启动子，分别对应于细胞内存在的 三种不同的三种不同的RNARNA聚合酶和相关蛋白质。聚合酶和相关蛋白质。 UPE:上游启动子元件上游启动子元件 rInr: 核糖体起始因子核糖体起始因子 Inr: 起始元件起始元件 DPE: 下游启动子元件下游启动子元件 编辑ppt24 基因组

18、（基因组（genomegenome）：细胞或生物体中，一套完整：细胞或生物体中，一套完整 单倍体单倍体的遗传物质的总和。的遗传物质的总和。 1 1个配子（精子或卵子），个配子（精子或卵子），1 1个单倍体细胞或个单倍体细胞或1 1个个 病毒所包含的全套基因，称为基因组。病毒所包含的全套基因，称为基因组。 人类基因组人类基因组包含多染色体和包含多染色体和XYXY两条性染色体上的两条性染色体上的 全部遗传物质（全部遗传物质（核基因组核基因组）以及胞线粒体上的遗）以及胞线粒体上的遗 传物质（传物质（线粒体基因组线粒体基因组）。）。 编辑ppt25 基因组基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体细胞或生物

19、体的一套完整单倍体 遗传物质的总和。遗传物质的总和。 编辑ppt26 物种物种基因组大小基因组大小( (Mb) )基因数基因数染色体数染色体数* * 支原体支原体 M. genitalium0.58470无无 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 H. influrnzae1.831743无无 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 B. subtilis4.204100无无 大肠杆菌大肠杆菌 E. coli 4.604288无无 酿酒酵母酿酒酵母 S. cerevisiae 13.50603416 裂殖酵母裂殖酵母 S. pombe12.50492916 燕麦燕麦 O. sativa4663000021 果蝇果蝇 D

20、. melanogaster165136014 秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫 C. elegans97184246 小鼠小鼠 mouse27003000020 人人 H. sapiens30002500023 编辑ppt27 基因组的功能是贮存和表达遗传信息。基因组的功能是贮存和表达遗传信息。 物种间基因组差异大。物种间基因组差异大。 结构与组织形式各异。结构与组织形式各异。 基因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸基因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸 分子中的分布和排布情况分子中的分布和排布情况. . 进化程度越高的生物其基因组越复杂进化程度越高的生物其基因组越复杂 编辑ppt28 基因

21、组学（基因组学（genomicsgenomics）： 发展和应用发展和应用DNADNA制图、测序技术，及计算机程制图、测序技术，及计算机程 序分析生命体序分析生命体全部基因组结构及功能的科学全部基因组结构及功能的科学。 包括：包括： 结构基因组学结构基因组学 功能基因组学功能基因组学 三个亚领域三个亚领域. . 比较基因组学比较基因组学 编辑ppt29 编辑ppt30 一、病毒基因组病毒基因组 二二、原核生物基因组原核生物基因组 三三、真核生物基因组真核生物基因组 编辑ppt31 一、病毒基因组病毒基因组 基因组（基因组（genomegenome） 1 1个配（精子或卵子），个配（精子或卵子）

22、，1 1个单倍体个单倍体 细胞或细胞或1 1个病毒所包含的全套遗传物质的总和个病毒所包含的全套遗传物质的总和。病毒核酸或。病毒核酸或 为为DNADNA或为或为RNARNA，可以统称为病毒染色体。，可以统称为病毒染色体。 完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不受完整的病毒颗粒具有蛋白质外壳，以保护病毒核酸不受 核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。核酸酶的破坏，并能识别和侵袭特定的宿主。 编辑ppt32 1.1.不同病毒基因组大小相差较大。不同病毒基因组大小相差较大。 2.2.不同病毒基因组可以是不同种类、结构的核酸。不同病毒基因组可以是不同种类、结构的核酸。 3.3.病毒基因组有连续

23、的也有不连续的，取决于宿主。病毒基因组有连续的也有不连续的，取决于宿主。 4.4. 编码区编码区 非编码区（非编码区（95%/5%95%/5%）。 5.5.单倍体基因组单倍体基因组 除逆转录病毒外。除逆转录病毒外。 6.6.基因有连续的和间断的。节段性基因基因有连续的和间断的。节段性基因 7.7.相关基因丛集相关基因丛集 转录出多顺反子转录出多顺反子mRNAmRNA 8.8.基因重叠基因重叠 9.9.病毒基因组含有不规则结构基因病毒基因组含有不规则结构基因 编辑ppt33 编辑ppt34反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期 反转录病毒反转录病毒 编辑ppt35 较小，简单较小，

24、简单 无真正的染色体无真正的染色体 染色体染色体基因组、也有基因组、也有质粒质粒 二二、原核生物基因组原核生物基因组 编辑ppt36 原核生物染色体基因组特点原核生物染色体基因组特点 1. 1. 通常仅有一条环状双链通常仅有一条环状双链DNADNA分子组成分子组成 2. 2.只有一个复制起点只有一个复制起点 3. 3.具有操纵子结构具有操纵子结构 4. 4.编码序列一般不重叠编码序列一般不重叠 5. 5.基因是连续的基因是连续的 6. 6.编码区在基因组中所占比例约为编码区在基因组中所占比例约为50%50% 7. 7.基因组中重复序列很少基因组中重复序列很少 8. 8.有编码同工酶的基因（有编

25、码同工酶的基因（isogeneisogene） 9. 9.存在可移动的存在可移动的DNADNA序列，包括插入序列和转座子序列，包括插入序列和转座子 10. 10.具有多种功能的识别区具有多种功能的识别区 质粒质粒 编辑ppt37 庞大、复杂多样庞大、复杂多样 复杂精细的基因调控机制复杂精细的基因调控机制 两个部分：染色体两个部分：染色体DNADNA、染色体外、染色体外DNADNA 非编码序列占非编码序列占95%95%以上以上 编辑ppt38 1.1.体细胞一般为体细胞一般为双倍体双倍体，即含有两份同源的基因组，即含有两份同源的基因组 2.2.基因组大，结构基因组大，结构复杂复杂、基因数庞大、具

26、有许多复、基因数庞大、具有许多复 制起点，每个复制子大小不一制起点，每个复制子大小不一 3.3.转录产物为转录产物为单顺反子单顺反子 编辑ppt39 4.4.含含大量重复序列大量重复序列 5.5.非编码序列占非编码序列占95%95%以上以上 6.6.基因是基因是断裂基因断裂基因 7.7.功能相关的基因构成各种功能相关的基因构成各种基因家族基因家族 8.8.存在存在可移动的遗传因素可移动的遗传因素 编辑ppt40 人类基因组的染色体人类基因组的染色体DNA DNA 编辑ppt41 环状环状DNADNA分子，分子，16569bp, 16569bp, 37 genes 37 genes (13 pr

27、otein (13 protein genes, 2 mt-rRNA genes and 22mt-tRNA genes)genes, 2 mt-rRNA genes and 22mt-tRNA genes) 基因排列紧密、无间隔区且部分重叠基因排列紧密、无间隔区且部分重叠 突变频率高，约为染色体突变频率高，约为染色体DNADNA的的10-2010-20倍倍 异质性和阀值效应异质性和阀值效应 200200余种疾病有关余种疾病有关 母系遗传母系遗传 线粒体线粒体DNADNA 编辑ppt42 真核基因组中存在大量重复序列真核基因组中存在大量重复序列 编辑ppt43 重复序列重复序列中，除编码中，除

28、编码rRNArRNA、tRNAtRNA、组蛋白及免、组蛋白及免 疫球蛋白的结构基因外，疫球蛋白的结构基因外，大部分是非编码序列大部分是非编码序列。 功能主要与基因组的结构稳定、组织形式以及功能主要与基因组的结构稳定、组织形式以及 基因表达的调控有关基因表达的调控有关 已发现一些重复序列与遗传病有密切联系已发现一些重复序列与遗传病有密切联系, ,可可 以通过测定重复次数而协助遗传病的诊断。以通过测定重复次数而协助遗传病的诊断。 编辑ppt44 1 1 高度重复序列高度重复序列 主要存在于染色体的主要存在于染色体的着丝粒区域着丝粒区域，成串排列成串排列，在人基，在人基 因组中约占因组中约占5%5%

29、6%6%。 重复频率可达重复频率可达10106 6以上，不编码蛋白质或以上，不编码蛋白质或RNARNA。短核苷酸重。短核苷酸重 复序列，在人基因组占基因组长度复序列，在人基因组占基因组长度20% 20% 。分两类：分两类： 反向重复序列（反向重复序列（inverted repeat sequenceinverted repeat sequence） 卫星卫星DNADNA（satellite DNAsatellite DNA） 两个相同顺序的互补拷贝在同一两个相同顺序的互补拷贝在同一DNADNA链上链上反向排列反向排列而成，而成， 重复单位长度约重复单位长度约300 bp300 bp，多数，多数

30、散在散在于基因组中，总长度于基因组中，总长度 约占人基因组的约占人基因组的5 5 。 编辑ppt45 串联重复顺序（串联重复顺序（tandem repeatstandem repeats） 所有串联重复所有串联重复DNADNA序列都称为序列都称为-卫星卫星DNADNA。 按重复长短分大卫星、按重复长短分大卫星、小卫星小卫星(15-65bp)(15-65bp)和和微卫星微卫星(2-6bp) (2-6bp) 。 * *卫星卫星DNADNA（satellite DNA satellite DNA ）又称随体又称随体DNADNA。 这部分这部分DNADNA是在用是在用csclcscl密度梯度离心时发现

31、的。密度梯度离心时发现的。 编辑ppt46 2 2 中度重复序列中度重复序列 重复数十至数千次重复数十至数千次, ,大多数与单拷贝基因大多数与单拷贝基因 间隔排列。中度重复序列在基因组长度间隔排列。中度重复序列在基因组长度1-30% 1-30% 。 平均长度约平均长度约300 bp300 bp500 bp500 bp，与长度约为，与长度约为1000 bp1000 bp的的 单拷贝序列间隔排列。拷贝数可达数十万。如单拷贝序列间隔排列。拷贝数可达数十万。如AluAlu家族、家族、 KpnIKpnI家族、家族、HinfHinf家族。家族。 平均长度为平均长度为3500 bp3500 bp5000bp

32、5000bp，与长度约为，与长度约为13000bp13000bp 的单拷贝序列间隔排列。的单拷贝序列间隔排列。 短分散重复片段短分散重复片段 (short interspersed nuclear elements(short interspersed nuclear elements，SINEs)SINEs) 长分散重复片段长分散重复片段 (long interspersed nuclear elements(long interspersed nuclear elements，LINEs) LINEs) 编辑ppt47 在单倍体基因组中只出现一次或数次，大多在单倍体基因组中只出现一次或数次

33、，大多 数为蛋白质编码的基因。数为蛋白质编码的基因。 贮存遗传信息贮存遗传信息 两侧分布重复序列两侧分布重复序列 编辑ppt48 假基因（假基因（pseudogene)pseudogene) 在多基因家族中某些与正常功能基因在核苷酸序在多基因家族中某些与正常功能基因在核苷酸序 列上相似，但不能转录或转录后生成无功能基因产列上相似，但不能转录或转录后生成无功能基因产 物的物的DNADNA序列，被称为假基因。序列，被称为假基因。 假基因常用符号假基因常用符号表示，如表示，如1 1 表示与表示与1 1 相相 似的假基因似的假基因. . 编辑ppt49 编辑ppt50 基因的基因的结构结构和功能分析和

34、功能分析 一一 基因一级结构分析基因一级结构分析 二二 启动子的结构及功能分析启动子的结构及功能分析 三三 编码序列结构分析编码序列结构分析 四四 基因拷贝数的分析基因拷贝数的分析 基因及基因组的分析基因及基因组的分析 编辑ppt51 一一 基因一级结构分析基因一级结构分析 基因一级结构基因一级结构: :脱氧核苷酸的排列顺序脱氧核苷酸的排列顺序。 基因一级结构的分析基因一级结构的分析: : DNADNA测序测序 DNA sequencing DNA sequencing 编辑ppt52 DNADNA测序技术的发展测序技术的发展 1. 1. 核酸测序最初在核酸测序最初在2020世纪世纪6060年

35、代，用部分酶解法测年代，用部分酶解法测RNARNA， 费时费力。费时费力。 2. 19772. 1977年英国年英国F.SangerF.Sanger创建了创建了双脱氧法双脱氧法， 同年美国同年美国 A.MaxamA.Maxam和和W.GilbertW.Gilbert创立了创立了化学降解法化学降解法。3 3人获得人获得19791979年年 诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。 3. 19863. 1986年，年，L.M.SmithL.M.Smith用用4 4色色荧光代替放射性核素荧光代替放射性核素标记。标记。 4. Taq DNA4. Taq DNA聚合酶应用于双脱氧法，建立了聚合酶应用于双脱氧法，建立

36、了PCRPCR测序。测序。 5. 19875. 1987年，年， DNA DNA序列序列自动测定仪自动测定仪问世。是问世。是双脱氧法，荧双脱氧法，荧 光标记法和激光检测法的结合光标记法和激光检测法的结合。 编辑ppt53 原理：原理： 在模板指导下，聚合酶不断将在模板指导下，聚合酶不断将dNTPdNTP加到引物的加到引物的3-OH3-OH 末端，使引物延长，合成出新的互补的末端，使引物延长，合成出新的互补的DNADNA链，如果加入链，如果加入 双脱氧三磷酸核苷（双脱氧三磷酸核苷（ddNTPddNTP）, ,由于由于双脱氧核糖的双脱氧核糖的33位置位置 上缺少一个羟基，故不能同后续的上缺少一个羟

37、基，故不能同后续的dNTPdNTP形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键， 即形成一种全部具有相同即形成一种全部具有相同5-5-引物端和以引物端和以ddNMPddNMP残基为残基为33 端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺 凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNADNA，从而读取，从而读取DNADNA 的核苷酸序列。的核苷酸序列。 编辑ppt54 编辑ppt55 引物标记法引物标记法 编辑ppt56 编辑ppt57 终止物标记法终止物标记法 编辑ppt58 原理：原理： 一个末端标记的一个末端标记的DNAD

38、NA片段在片段在4 4组组互相独立的化学反应中互相独立的化学反应中 分别得到分别得到部分降解部分降解，其中每一组反应特异的针对某一，其中每一组反应特异的针对某一 种或某一类碱基。生成种或某一类碱基。生成4 4种放射性标记的分子，从共同种放射性标记的分子，从共同 起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显 影来检测末端标记的分子。影来检测末端标记的分子。 编辑ppt59 反应体系反应体系修饰试剂修饰试剂修饰反应修饰反应链断裂试剂链断裂试剂断裂点断裂点

39、 G G硫酸二甲酯硫酸二甲酯 （DMSDMS） G G甲基化甲基化六氢吡啶六氢吡啶G G G+AG+A甲酸甲酸脱嘌呤作用脱嘌呤作用六氢吡啶六氢吡啶G G和和A A C+TC+T肼肼嘧啶开环嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶C C和和T T C C肼（加盐）肼（加盐）C C六氢吡啶六氢吡啶C C 编辑ppt60 编辑ppt61 二二 启动子的结构及功能分析启动子的结构及功能分析 一）、启动子的结构分析一）、启动子的结构分析 二二）、启动子的功能分析、启动子的功能分析 编辑ppt62 启动子（启动子（promoterpromoter） 是一段能被蛋白质识别的、参与特定基因转录是一段能被蛋白质识别的、参与特定

40、基因转录 调控的调控的DNADNA序列。序列。 IIII型启动子通常位于结构基因的上游。型启动子通常位于结构基因的上游。 共通序列共通序列(consensus sequence)(consensus sequence)是其特征性序是其特征性序 列。列。 编辑ppt63 +10 +20 Start site -10-20-30-40 +1 ATGATG -3+5 Initiator Initiator 原核基因的共通序列：原核基因的共通序列： -10-10区：区：Pribnow boxPribnow box（T77A76T60A61A56T82T77A76T60A61A56T82序列）序列） -

41、35-35区：区：T69T79G61A56C54A54 T69T79G61A56C54A54 序列序列 真核基因的共通序列：真核基因的共通序列： 真核基因启动子在真核基因启动子在-50-50区域附近（大约区域附近（大约5%30%5%30%基因启动子在基因启动子在 -25-30-25-30区域）有区域）有TATA boxTATA box（TATAAATATAAA序列序列） TATAATTTGACA 编辑ppt64 一、启动子的结构分析一、启动子的结构分析 主要方法：主要方法： 利用利用PCRPCR技术克隆启动子技术克隆启动子 利用核酸利用核酸- -蛋白质相互作用方法研究启动子蛋白质相互作用方法研

42、究启动子 生物信息学预测启动子生物信息学预测启动子 编辑ppt65 95 变性变性 55 退火退火 72 延伸延伸 30 cycles PCRPCR是一种对特定的是一种对特定的DNADNA片段在体外进行快片段在体外进行快 速扩增的技术。速扩增的技术。 将微量的目的将微量的目的DNADNA在体外扩增在体外扩增100100万倍以上万倍以上 编辑ppt66 引物（引物（primerprimer）: :化学合成的寡聚核苷酸化学合成的寡聚核苷酸 酶酶 : Taq DNA polymerase : Taq DNA polymerase 底物底物: dNTP : dNTP （dATP,dGTP,dCTP,d

43、TTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （templatetemplate）: : DNA DNA MgMg2+ 2+ （ （magnesiummagnesium）: : Buffer Buffer 编辑ppt67 （一）利用（一）利用PCRPCR技术克隆启动子技术克隆启动子 特异性基因序列 基因上游序列基因组DNA 根据基因序列合成一条反向引物 正向引物用随机引物 PCR扩增 随机引物 特异引物 克隆及测序分析 根据已知基因序列直接进行根据已知基因序列直接进行PCRPCR扩增扩增 编辑ppt68 （二）利用核酸（二）利用核酸- -蛋白质互作方法蛋白质互作方法 启动子是一段能

44、被蛋白质识别和结合的启动子是一段能被蛋白质识别和结合的DNADNA 序列，因此，能够检测核酸序列，因此，能够检测核酸- -蛋白质相互作用蛋白质相互作用 的研究方法都可以用于启动子的研究中的研究方法都可以用于启动子的研究中 主要方法：主要方法： 足迹法（酶足迹法，化学足迹法）足迹法（酶足迹法，化学足迹法） 电泳迁移率变动实验（电泳迁移率变动实验（EMSAEMSA） 染色体免疫沉淀（染色体免疫沉淀（ChIPChIP） 编辑ppt69 I 足迹法（足迹法（Footprinting） 利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结 合的DNA区域. (酶足迹法，化学足迹法） 基本流程： DNA与

45、蛋白质相互作用 切割DNA 凝胶电泳 分析电泳图谱 编辑ppt70 酶足迹法酶足迹法 ( (Enzymatic footprinting) ) 用能切割用能切割DNADNA的酶处理的酶处理DNA-DNA-蛋白质混合物，然后电泳分析蛋白质混合物，然后电泳分析 DNase IDNase I足迹法足迹法 (DNase I footprinting) 核酸外切酶核酸外切酶IIIIII足迹法足迹法 (Exonucleoase III footprinting) 编辑ppt71 DNase I 足迹法足迹法 dsDNA 单链末端标记 DNA结合蛋白 DNase I 酶切消化 （控制反应时间） 产生长短不同

46、的片段 但蛋白质结合区被保护 编辑ppt72 蛋白质结合区 M No-pro Pro-DNA 对在凝胶上出现空白区域的DNA进行克隆测 序，即可确定结合蛋白质的DNA序列 变性凝胶电泳 编辑ppt73 化学足迹法化学足迹法 ( (Chemical footprinting) ) 是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复 合物，从而通过化学试剂无法接近结合蛋白质的DNA 区域而确定DNA的蛋白质结合位点 主要方法： 羟自由基足迹法 体内足迹法 编辑ppt74 羟自由基足迹法羟自由基足迹法 （Hydroxyl radical footprinting） 化学试剂羟自由基 利用化学试剂产

47、生的羟自由基攻击DNA分子表面脱氧核糖骨 架使DNA断裂 当DNA结合蛋白将脱氧核糖遮盖时，自由羟基无法攻击而使 这个区域的DNA受到保护 电泳图谱上出现空白区的地方就是结合蛋白质的DNA 变性凝胶电泳 编辑ppt75 体内足迹法体内足迹法 （In vivo footprinting） 用化学试剂对活细胞进行体内处理，使用化学试剂对活细胞进行体内处理，使DNADNA在细胞内受到化学修饰在细胞内受到化学修饰， 然后裂解细胞，用化学法或酶法进行足迹实验。然后裂解细胞，用化学法或酶法进行足迹实验。 甲基化干扰实验甲基化干扰实验 (Methylation interference assay) 利用化

48、学试剂如硫酸二甲酯（利用化学试剂如硫酸二甲酯（Dimethyl sulfate, DMSDimethyl sulfate, DMS）对活）对活 细胞细胞DNADNA进行甲基化修饰，从而干扰蛋白质与进行甲基化修饰，从而干扰蛋白质与DNADNA的结合。的结合。 乙基化干扰实验乙基化干扰实验 (Ethylation interference assay) 是利用化学试剂对活细胞是利用化学试剂对活细胞DNADNA进行乙基化修饰，从而干扰蛋白进行乙基化修饰，从而干扰蛋白 质与质与DNADNA的结合。的结合。 编辑ppt76 化学试剂 提取DNA DNase I 或化学试剂 变性凝胶电泳分析 切割DNA

49、化学修饰对蛋白质与化学修饰对蛋白质与DNA的结合的结合 有干扰，因此，体内足迹实验也有干扰，因此，体内足迹实验也 叫干扰实验叫干扰实验 电泳图谱需与未修饰的电泳图谱需与未修饰的DNA样品样品 进行比较，在未修饰样品中出现进行比较，在未修饰样品中出现 空白区的位置是体内发生化学修空白区的位置是体内发生化学修 饰的饰的DNA区域区域 正常对照化学修饰 提取DNA 编辑ppt77 (electrophoretic mobility shift assays) 原理：原理： DNADNA凝胶电泳中，凝胶电泳中，DNADNA朝正极移动的速度与分子朝正极移动的速度与分子 量负相关，如果该量负相关，如果该D

50、NADNA分子与某种蛋白质结合，则分分子与某种蛋白质结合，则分 子量增大，它在凝胶中的迁移便会受到阻滞。子量增大，它在凝胶中的迁移便会受到阻滞。 又称为凝胶阻滞实验又称为凝胶阻滞实验(Gel retardation assay) II DNA/RNA EMSA 电泳迁移率变动实验电泳迁移率变动实验 编辑ppt78 EMSA步骤步骤： 制备探针制备探针DNADNA（32P32P） 提取蛋白质提取蛋白质 探针及蛋白质提取物一起温育，形成探针及蛋白质提取物一起温育，形成DNA-DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 放射自显影显现放射自显影显现

51、 编辑ppt79 细胞蛋白质提取物 标记的DNA片段 蛋白质与DNA结合 蛋白质-DNA复合物 电泳迁移滞后 凝胶电泳 显影 滞后条带表明DNA 是与蛋白质结合的 区域 编辑ppt80 在生理状态下，把细胞内在生理状态下，把细胞内染色体染色体DNADNA 与蛋白质交联与蛋白质交联在一起，将染色体切割成在一起，将染色体切割成 小片段并沉淀下来小片段并沉淀下来 甲醛或其他交联剂固定蛋白质复合物甲醛或其他交联剂固定蛋白质复合物 特异抗体沉淀复合物特异抗体沉淀复合物 接触偶联，纯化目的片段接触偶联，纯化目的片段 检测检测 III 染色体免疫沉淀技术染色体免疫沉淀技术 (Chromatin immuno

52、precipitation, ChIP) 编辑ppt81 细胞的甲醛固定细胞的甲醛固定 超声波断裂染色质超声波断裂染色质 氯化铯等密度离心纯化交联的染色质氯化铯等密度离心纯化交联的染色质 染色质免疫沉淀和复合物的纯化染色质免疫沉淀和复合物的纯化 交联反应的逆转和交联反应的逆转和DNADNA的纯化的纯化 沉淀下来的沉淀下来的DNADNA的分析和蛋白质在的分析和蛋白质在DNADNA上结合位点的鉴定上结合位点的鉴定 目的蛋白和目的蛋白和DNADNA靶序列特异结合的进一步验证靶序列特异结合的进一步验证 ChIP的主要步骤的主要步骤 编辑ppt82 EPD (Eukaryotic promoter da

53、tabases) TRRD (Transcription regulatory regions databases) 基因基因转录起始点数据库转录起始点数据库 (DBTSS) 启动子数据库启动子数据库 这些数据库主要通过计算机识别、判断及分析，这些数据库主要通过计算机识别、判断及分析， 在数据库中寻找启动子的特异性特征结构。在数据库中寻找启动子的特异性特征结构。 （三）生物信息学预测启动子（三）生物信息学预测启动子 编辑ppt83 二、启动子的功能分析二、启动子的功能分析 通过连接报告基因研究启动子的功能。通过连接报告基因研究启动子的功能。 1. 1. 报告基因报告基因 (Reporter g

54、ene)(Reporter gene) 在在培养细胞或动植物体内作为筛选标志的培养细胞或动植物体内作为筛选标志的易检测信号易检测信号，通，通 过分子生物学操作将发光蛋白或酶的编码基因附加到一个过分子生物学操作将发光蛋白或酶的编码基因附加到一个 感兴趣基因上或插入基因调控序列下游，从而监测感兴趣感兴趣基因上或插入基因调控序列下游，从而监测感兴趣 基因的表达或分析基因的表达或分析基因调控序列的活性基因调控序列的活性。 编辑ppt84 常用的报告基因常用的报告基因 荧光蛋白编码基因：荧光蛋白编码基因： 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 (GFP) 红色荧光蛋白红色荧光蛋白 (dsRed) 蛋白酶：蛋白酶：

55、荧光素酶荧光素酶 (luciferase) - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 在蓝色光源照射下在蓝色光源照射下 发绿光发绿光 能催化荧光素能催化荧光素 (luciferin)(luciferin) 发生氧化反应发光发生氧化反应发光 能使细菌在能使细菌在X-galX-gal存在条存在条 件下变成蓝色件下变成蓝色 编辑ppt85 2. 2. 报告基因的应用报告基因的应用 监测基因的转染效率监测基因的转染效率 报告基因与目的基因分别插入各自启动子下游，实现报告报告基因与目的基因分别插入各自启动子下游，实现报告 基因的组成性表达模式基因的组成性表达模式 监控目的基因的表达监控目的基因的表达 报告基因与目的基

56、因融合共同受控于一个启动子，报告基因报告基因与目的基因融合共同受控于一个启动子，报告基因 的表达即代表目的基因的表达的表达即代表目的基因的表达 研究启动子的活性研究启动子的活性 报告基因插入被研究启动子下游，通过观察报告基因的表报告基因插入被研究启动子下游，通过观察报告基因的表 达情况推测启动子活性达情况推测启动子活性 编辑ppt86 启动子捕获技术启动子捕获技术 (promoter trapping)(promoter trapping)： 是一种研究启动子活性的筛选方法是一种研究启动子活性的筛选方法 基本流程：基本流程： 构建启动子捕获载体构建启动子捕获载体 观察报告基因的表达观察报告基因

57、的表达 报告基因报告基因 MCSMCS ori 候选启动子序列候选启动子序列 插入插入MCSMCS 转染细胞转染细胞 观察报告基因的表达观察报告基因的表达 启动子捕获载体启动子捕获载体 编辑ppt87 制备目的基因制备目的基因 载体的选择载体的选择 目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接 将重组体导入受体细胞将重组体导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定 编辑ppt88 酵母单杂交酵母单杂交 编辑ppt89 nDNA结合结合域域（DNA-BD）：）：N端端1-147氨基酸氨基酸,可可 识别并结合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列识别并结合酵母半乳糖苷酶的上游激活序列 (UAS)

58、。 n转录激活转录激活域域（AD）：）：C端端786-881氨基酸氨基酸,通过通过 同转录机制的其它成分之间的结合以启动上游激同转录机制的其它成分之间的结合以启动上游激 活序列（活序列（UAS）下游的基因转录。）下游的基因转录。 编辑ppt90 酵母单杂交酵母单杂交 步骤步骤： 设计含目的基因（诱饵）和下游报告基因的质粒，设计含目的基因（诱饵）和下游报告基因的质粒， 将其转入酵母细胞中。将其转入酵母细胞中。 将文库蛋白的编码基因片段与将文库蛋白的编码基因片段与GAL4GAL4转录激活域转录激活域 （ADAD）融合表达的）融合表达的cDNAcDNA文库质粒转化入同一酵母细文库质粒转化入同一酵母细

59、 胞中。胞中。 若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基 因的表达将其筛选。因的表达将其筛选。 编辑ppt91 编码序列编码序列 (coding sequence)(coding sequence)： 通常是指能体现在蛋白质氨基酸序列通常是指能体现在蛋白质氨基酸序列 中的基因信息。中的基因信息。 三三 编码序列结构分析编码序列结构分析 编辑ppt92 一）、基因编码序列的结构特征一）、基因编码序列的结构特征 特征性序列：特征性序列： 开放阅读框架开放阅读框架 蛋白质翻译的起始密码子和终止密码子蛋白质翻译的起始密码子和终止密码子 真核基因的外显子（编码

60、序列）和内含子真核基因的外显子（编码序列）和内含子 （非编码序列）之间有特殊序列（非编码序列）之间有特殊序列 编辑ppt93 开放阅读框架开放阅读框架 (open reading frame, ORF) (open reading frame, ORF) 指生物基因组中含有潜在编码蛋白质的一段核苷酸序列指生物基因组中含有潜在编码蛋白质的一段核苷酸序列 在基因序列中，在基因序列中，ORFORF位于起始密码子（位于起始密码子（start codonstart codon）和终止）和终止 密码子（密码子（stop codonstop codon）之间）之间 密码子：密码子： 是由三个核苷酸组成的是由