大鼠容量超负荷早期心室压力变化和心肌原癌基因c-fos、c-.

1、大鼠容量超负荷早期心室压力变化和心 肌原癌基因 c-fos 、c-jun 、 c-myc、 egr-1 的表达 关键词：心室功能；原癌基因；基因表达 中国病理生理杂志 000705 摘 要 目的：检测大鼠心脏容量超负荷 (volume overload , VOL时左心室内压变化诱导心肌原癌基因c-fos、c-jun、 c-myc、egr-1 mRNA表达的时间变化规律。方法：测定 VOL、假手术对照组大 鼠术后30 min、1、4、6、12及48 h左心室收缩压(LVSP)和舒张末压 (LVEDP)，用狭缝杂交检测2组各时间左室心肌原癌基因表达，用密度仪进行定 量分析。结果:VOL大鼠术后L

2、VSP显著低于假手术组(PvO.05) , 48 h最低；术 后30 min LVEDP高于假手术组(P0.05);假手术组和阴性对照各原癌基因无阳性表达，AVF后 1 h检测到c- fos、c-jun、egr-1 mRNA表达，4 h检测到c-myc表达，均于4 h出现表达峰 值，此后减弱，48 h c-fos无表达，c-jun表达较弱，c-myc和egr-1仍有较 高表达。结论：VOL大鼠LVEDP曾加，首先诱导c-fos、c-jun、egr-1表达， c-myc 表达较晚， c-myc、 c-jun 、 egr-1 表达持续时间较长，可能反映了活体 VOL刺激心肌原癌基因表达时间变化规律

3、；当室壁受到一定程度和一定时间的 负荷牵拉后心肌原癌基因即开始表达，负荷的强弱可能并非重要因素。 中分类号 Q754； K346.1 文献标识码 A 文章编号 1000-4718(2000)07-0592-04 Correlation between intraventricular pressure and early phase proto-oncogene expression in volume overload rats HU Xiao-ping (Department of Pathology, Punan Hospital, Shanghai 200125, China) LI

4、He ， ZHANG Guo-yua，n WU Zong-gui (Department of Cardiology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China) FEI Jian (Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai 200031, China) Abstract AIM: To investigate the effect of intraventricular p

5、ressure change by volume overload (VOL) on expression of protooncogene c-fos,c-jun,c-myc and egr-1. METHODS: Left ventricular systolic pressure(LVSP) and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) of rat with VOL induced by aortacaval fistula operation and rats of control group were measured at

6、 30 min, 1, 4, 6, 12 and 48 h after the operation,these mRNAs at the foregoing time points were measured by slot bloting method and quantified with densitometry. RESULTS: Be compared with the control group, VOL rats LVSP decreased (P0.05) and declined most remarkably at 48 h,LVEDP elevated significa

7、ntly at 30 min (P0.05) after the operation.The proto-oncogene expression signals were not detected in the control,negative controls and VOL rats at 30 min after the operation. The c-fos,c-jun and egr-1 mRNA signals appeared earlier,at 1 h, and c-myc mRNA increased later at 4 h.All reached peak value

8、 at 4 h and then declined gradually.The c-fos mRNA were not detected at 48 h. The c-myc,c-0jun and egr-1 mRNA persisted throught the entire observation period from 1 h to 48 h. CONCLUSIONS: During VOL early phase the overload have effect on expression of the proto-oncogene mRNA,c- fos,c-jun and egr-

9、1 mRNA appear earlier, c-myc later, egr-1,c-jun and c-myc persist longer period, but the expressions do not strengthen with the ventricule wall load increase.This sequential induction pattern may reflect the time course regularity of the proto-oncogenes expression induced by VOL,and indicate the pro

10、to-oncogenes expression initiate while the heart load accumulate some extent and duration and the load magnitude may not play a critical role. MeSH Ventricular function; Proto-oncogenes; Gene expression 长期血流动力学负荷增加心脏将发生代偿性心肌肥厚，然而左心室肥 厚又是发生心力衰竭、心肌梗塞和猝死的独立危险因素。原癌基因编码的蛋白 生长因子、生长因子受体、细胞内信息传递器及核转录因子对细胞生长

11、、增 殖、分化发挥重要作用。已经证明，心肌肥厚发生过程极早期多种原癌基因有 短暂表达，对调节心脏特异性基因的转录及心肌肥厚的发生可能起重要作用。 心脏对不同刺激的应答心肌原癌基因表达表现出刺激特异性以及不同的时 间、空间次序14，这对其下游特异性基因表达和心肌肥厚的发生可能有特殊意 义。目前对心脏超负荷诱导成年哺乳动物心肌肥厚的早期分子和细胞变化还不 完全清楚，对活体容量超负荷(VOL)诱导心肌原癌基因表达的研究较少，国内尚 无研究报告。因此，我们用核酸杂交的方法检测大鼠活体心脏VOL早期左心室 压力与 3 个不同家族的转录因子：亮氨酸拉链 (leucine zipper) 结构 c-fos

12、、 c-jun，锌指(zi nc fin ger) 结构 egr-1 和螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix) 结 构 c-myc 心肌原癌基因表达时间变化规律。 材料和方法 、大鼠容量超负荷模型建立 雄性Wistar大鼠(体重：200250 g)，参照Garcia等的方法，以 18G针头进行腹主动脉-腔静脉穿刺建立动静脉痿(aorta vena caval fistula ，AVF)。为减少手术对原癌基因表达的影响，尽可能缩短手术时间， VOL大鼠(n=4)完成AVF时间为59 min。假手术对照组(n=4)除不进行穿刺外 处理步骤相同。二组大鼠分别于术后 30 min、1、4、

13、6、12、48 h 参照 Litwin 等的方法左心室穿刺，用 HP78560A型中心监测仪(Hewlett Packard CO,USA) 检测左心室收缩压 (left ventricular systolic pressure, LVSP)和舒张末压 (left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)。心室压力检测后处死 动物，迅速取出心脏，分离左心室，液氮中速冻后转移至 -70C冰箱中保存。 、mRN检测 使用TRIzol(GibcoBRL)抽提左心室心肌总RNA用紫外分光光度计以 260 nm进行定量。按标准方法进行狭缝杂交。以B -act

14、in为内对照、酵母 tRNA为阴性对照。大鼠 c-fos、c-jun、c-myc、egr-1、B -actin mRNA 寡核苷 酸探针：c-fos 5 -CAAGT TGATC TGTCT CCGCT CGTAT CT3GT；-c-jun 5 - GATGT GCCCA TTGCT GGACT GGATG ATCA myc 5 -TTGTT CTTCT TCAGA GTCGC TGCTG GTGGT -; egr- 1 5 -TGGGA GGCAG AGGAA GACGA TGAAG CAGCT3 ; B - actin 5 -CCTAG AAGCA TTTGC GGTGC ACGAT GG

15、AG由中 科院上海细胞生物学研究所基因工程实验室合成 )。用T4多聚核苷酸激酶 (Promega CO.)、32 P- 丫 ATP(Amersham CO.)进行 5 端标记寡核苷酸探针， 标记后比活性为109 counts*min -1* yg-1。用狭缝杂交板转膜(Hybond- N,Amersham后，加入探针，55C杂交16 h后洗膜、进行放射性自显影。用电 脑象分析仪检测杂交信号的相对光密度(IOD)。每组实验重复三次，计算上述原 癌基因mRNA杂交信号与内对照B -actin mRNA IOD的比值，所有检测结果用此 比值表示，以各组最早的阳性表达为 100%。 、数据分析 试验数

16、据以均值土标准差(土 s)表示，用Bonferroni t 和Student t 检验判断均数差异显著性。 结果 、AVF术后大鼠左心室LVSP和LVEDF变化时间过程（1） VOL组大鼠 AVF后 30 min LVSP 低于对照组 29%(P0.05), 48 h 低于 对照组 42%(P0.05), LVEDP术后 30 min 高于对照组 283%(P0.05), 12 h 为 700%(P0.05)。 Fig 1 Showing the time point changes of LVP after the AVFs, n=4; * P0.05, vs control; # P0.0

17、5, vs other after AVF 1 AVF 术后左心室压力变化 二、VOL大鼠心肌c-fos、c-jun、c-myc和egr-1 mRNA表达变化时间 过程(表1、 2) AVF后 30 min未检测出各原癌基因表达，均于术后 4 h出现表达峰 值。术后 1 h c-fos mRNA 可见微弱表达, 4 h 表达增强,为 1 h 的 547%(P0.05)， 6 h 为 234%(P0.05)， 12 h 表达水平与 1 h 相近， 48 h 无表 达；同样，AVF后 1 h c-jun mRNA表达较弱，4 h表达为1 h的 578%(P0.05)，12 h 表达水平与 1 h

18、接近，48 h 为 1 h 的181%(P0.05)；术后1 h检测到egr-1 mRNA表达，4 h表达为前者 336%(P0.05)，此后6、12、48 h表达水平增强分别为1 h的166% 297%(P0.05)、259%(P0.05)，48 h表达水平显著低于6 h(P0.05) ，较前平均水平低 22%。 三、假手术对照组和阴性对照无阳性表达。 Fig 2 Slot blot analysis showing changes of c-fos,c-myc,c- jun,egr-1 mRNA expression after AVF 2 AVF术后 c-fos,c-myc,c-jun,

19、egr-1 mRNA表达变化 表 1 VOL大鼠心肌 c-fos、c-jun、c-myc 和 egr-1 mRNA IOD Tab 1 IOD of c-fos,c-jun,c-myc and egr-1 mRNA in myocardium of VOL rats (s,n=4) Time point after VOL (h) Control 0.5 4 6 12 48 h c-fos 0.12 0.02 # 0.62 0.12 0.28 0.02 *# 0.12 0.03# c-jun 0.160.02# 0.99 0.06 0.24 0.09*# 0.10 0.01# *# 0.290

20、.04*# c-myc 0.22 0.03 0.26 0.04 0.21 0.06 0.17 0.01 egr-1 # 0.42 0.05 # 1.38 0.22 0.68 土 0.09 # 1.23 0.09 * 1.07 0.10?* *P0.05， vs 1 h; #P0.05 ， vs 4 h; P0.05, vs 12 h; P0.05, vs 6 h, 12 h 讨 论 AVF模型为经典的VOL模型，回心血量、LVEDF显著增高，心排血量增 加，而外周阻力下降，可认为AVF模型心脏无后负荷增加。与大鼠离体灌注 心脏VOL心肌原癌基因表达实验结果3，4基本相同，本实验观察到c-fos

21、、c- jun、egr-1、c-myc mRNA表达水平增加，说明活体左心室前负荷异常增高可 以诱导心肌原癌基因表达。对心脏负荷刺激通过何种分子机制，如何启动心肌 细胞肥厚的基因表达还不清楚。研究表明，牵拉心肌细胞可诱导 c-fos 基因表 达，牵拉响应元件(stretch response element)位于c-fos 基因DNA的5-侧 翼9；机械性负荷可使牵拉激活性离子通道 (stretch-activated ion (SA) channel)开放，SA开放增加细胞内CoT浓度可诱导心肌c-fos、c-jun表达增 高，SA可能有启动心肌肥厚信号的机械性感受器作用；整合蛋白(inte

22、grin) 可作用于多种细胞内信号分子，对介导牵拉诱导的细胞反应可能起关键作用， 很可能是将机械性信号转变为细胞内第二信使信号的机械性感受器，但阻断整 合蛋白仍不能抑制 c-fos 表达。因此其在诱导心肌肥厚中的作用仍需进一步阐 明 2 与离体心脏实验35不完全相同，本实验检测出原癌基因表达和出现峰 值的时间较晚，持续时间长。本实验观察到 c-fos 、 c-jun 、 egr-1 首先表达， c-myc较晚，c-fos表达水平下降较快；c-jun、egr-1、c-myc mRNA表达持续 时间较长， 48 h 仍有较高的表达，这种表达时间变化过程反映出心脏负荷诱导 活体和离体心肌原癌基因表达

23、变化的不同，原癌基因持续表达对VOL诱导心肌 肥厚可能有重要意义。 VOL导致心肌肥厚是心室对舒张末室壁负荷增加的应答反应，最终导 致心腔容积增加，室壁厚度增加将使室壁所受的负荷恢复正常。AVF后早期(24 h)心肌重量无明显变化，1周时则可见明显的心肌肥厚 。根据La Place定律 (室壁负荷与心室内压力、心室内径呈正比，与室壁厚度呈反比 )，应认为 LVEDP增加时舒张末室壁负荷显著增加。本实验原癌基因表达峰值均出现于术 后4 h，并非LVEDP增高最显著的术后12 h ; c-fos、c-jun mRNA表达峰值后 较短时间内水平明显下降，而 c-myc、egr-1 mRNA则持续较高

24、水平地表达，未 见随LVEDP变化的趋势。提示心脏VOL时，当室壁受到一定程度、和一定时间 的负荷牵拉，心肌原癌基因即开始表达，并且负荷达到一定程度后其强弱可能 并非重要影响因素。 Slinker 等4 观察到，给离体兔左心室不同的负荷，仅30 min c-fos 表达与左室舒张末容积(EDV)有密切关系，60 min时EDV寸c-fos、 egr-1 表达无明显影响。 Schunkert 等10 的实验观察到，当抑制心肌主动收缩 时，给予左心室不同负荷使心肌被动牵拉，各种负荷诱导 c-fos 、 c-jun mRNA 表达水平无差异；当左室前负荷固定， c-fos 、 c-jun mRNA

25、表达水平与左室单 位重量心肌产生的主动左室收缩压的高低成正相关，提示LVEDP勺变化不是诱 导左室心肌c-fos、c-myc mRNA表达的主要因素。这些观察结果似乎还得到临 床证据的支持，研究发现许多高血压患者仅轻度血压增高就出现左心室肥厚， 并且高血压患者与正常人严格配寸的研究表明实际所有高血压患者均有左心室 肥厚 1 。 牵拉和血管紧张素U (Ang II)均可激活多种第二信使信号分子、导致心 肌细胞肥厚，由于大鼠VOL早期就可激活循环、心脏肾素血管紧张素系统2, 心脏Angl增加是否通过影响心肌原癌基因表达对发生心肌肥厚起一定作用， 本实验结果尚不能阐明。 基金资助 国家自然科学基金部

26、分资助 (39470838) 参 考 文 献 1 Susic D, Frohlich ED.Left ventricular hypertrophy : pathophysiological and molecular biological J.Hypert Res, 1993, 16: 163 177. 2 Sadoshima J,Izumo S.The cellular and molecular response of cardiac myocytes to mechanical stress J.Annu Rev Physiol, 1997,59:551 571. 3 Kolbeck-

27、Ruhmkorff C,Zimmer H.Proto-oncogene expression in the isolated working rat heart combination of pressure and volume overload with norepinephrineJ. J Mol Cell Cardiol, 1995,27:501 511. 4 Slinker BK,Stephens RL,Fisher SA,et al.Immediate-early gene responses to different cardiac loads in the ejecting rabbit left ventricule J.J Mol Cell Cardiol, 1996,28:15651574. 5 Garcia G,Diebold S. Simple, rapid and effective method of producing aortocaval shunt in the rat J.Cardiovasc Res, 1990, 24: 430 432. 6 Litwin SE, Katz SE, Weiberg EO,et al. Serial echocardiographic -doppler assessment of left ve