新编发酵工程教案(打印)

1、发酵工程 发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。 现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。 发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术(1) 有严格的无菌生长环境： 包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及

2、各种连接管道进行灭菌的技术； 在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题微生物发酵技术 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”

3、 巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。 同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。 利用微生物的特点 发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌 利用微生物的特点： (1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力 (2)有极强的消化能力 (3)有极强的繁殖能力 一、发酵的定义1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵1、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁

4、产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出co2。3、工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，包括：1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也有菌体细胞、酶等。二、发酵工业定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。2.获得发酵产品的条件 适宜的微生物 保证或控制微生物进行代谢的各

5、种条件 进行微生物发酵的设备 精制成产品的方法的设备三、发酵工业的发展历史 天然发酵阶段 纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。 通气搅拌发酵技术的建立：青霉素的生产深层培养 代谢控制发酵技术：微生物进行甾体化合物的转化，glu和lys发酵生产。对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成手段的一部分加以利用，进行合理的代谢。 开拓发酵原料时期：石油发酵，醋酸生产谷氨酸 基因工程阶段：采用酶学的方法，将不同来源的dna进行体外重组，再把重组dna设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传下去。人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功

6、能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。第二章 生产中常用菌种的分离、选育和保藏 第一节 菌种的分离简介 一、菌种的来源 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。三、新种分离与筛选的步骤 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对

7、性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适ph值、提取工艺等。（一）采样1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取

8、离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还

9、必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 （四）筛 选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。七、生产选种 是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发

10、现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好的方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。第二节 诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变 一、诱变剂和诱变处理 物理诱变剂：射线如紫外线、x射线、射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中

11、小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更

12、要当心。诱变剂的选择1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。二、诱变育种步骤(一)出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱

13、变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。 5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。 (二)处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。(三)诱变处理 根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱

14、变对象的实际，设计诱变处理方案。 (四)中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(五)分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分

15、离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15w紫外线杀菌灯，波长为2537a灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个

16、ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 (二)操作步骤 1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌悬液。 3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁

17、力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15w紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。 4取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。第四节 菌种的衰退、复壮与保藏一、菌种的衰退 衰退的原因：1.菌种保藏不当2.菌种生长条件没有得到满足二、 菌种的复壮 1. 纯种分离 2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰

18、已衰退的个体三、菌种保藏 1.原理 人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。 低温、干燥、缺氧、缺营养物质 2. 方法 （1）斜面保藏法：用螺旋口试管防失水，尽量减少碳源含量 （2）干燥保藏法：沙土管，固体曲 （3）悬液保藏法：将微生物悬浮在不含养分的溶液中(水、生理盐水、buffer) （4）冷冻干燥保藏法：冷冻，减压蒸发除去水分，使生命活动停止 （5）低温保藏法：大多数微生物可在-20以下的低温中保藏，比冷冻干燥更为常用。 （6）液氮保藏法第三章 微生物的代谢一、微生物的代谢产物初级代谢产物定义：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。举例：氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维

19、生素等。特征：不同的微生物初级代谢产物基本相同；初级代谢产物合成过程是连续不断的。一、微生物的代谢产物次级代谢产物定义：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。举例：抗生物、毒素、激素、色素等。特征：不同的微生物初级代谢产物不同；抗生素是一类具有特异性抑菌和杀菌作用的有机化合物。二、微生物代谢的调节酶合成的调节微生物细胞内酶的种类：组成酶：微生物细胞内一直存在，合成是受遗传物质控制。诱导酶：在环境中存在某种物质的情况下才能够合成的酶。举例：亮白曲霉原来不能合成蔗糖酶，所以不能利用蔗糖，但如果在培养基内加入蔗糖，一段时间后，可

20、合成蔗糖酶，并利用蔗糖。二、微生物代谢的调节酶活性的调节二、微生物代谢的调节两种调节的对比三、微生物代谢的人工控制目的最大限度积累对人类有用的代谢产物 措施改变微生物遗传特性控制生产过程种各种条件实例人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸；人工控制谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸。人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸黄色短杆菌的代谢过程 第四章 培养基及其制备从微生物营养要求看，所有微生物都需要碳源，氮源，无机元素，水及生长物质。如果是好氧微生物还需要氧气。在实验室规模上配制含有纯化合物的培养基非常简单，但在大规模生产上是不合适的。第一节 工业发酵培养基发酵培养基的作用： -满足菌体的生长 -促进产

21、物的形成一、工业上常用的碳源（carbon source）1. 应用最广的是谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉），淀粉水解后得葡萄糖。使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点： a.难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶。 b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点： 来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。 2. 葡萄糖-所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。-工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标。3.糖蜜制糖工业上的废糖蜜或结晶母液 包括：甘蔗糖蜜糖高，氮少 甜菜糖蜜 糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，对发酵产生不利的影响，需要进

22、行预处理。二、工业上常用的氮源（nitrogen source）1.无机氮(迅速利用的氮源)种类：氨水、铵盐或硝酸盐、尿素 特点：吸收快，但会引起ph值的变化 选择合适的无机氮源有两层意义： -满足菌体生长 -稳定和调节发酵过程中的ph无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素2.有机氮：来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。其中玉米浆（玉米提取淀粉后的副产品）和豆饼粉既能做氮源又能做碳源。成分复杂：除提供氮源外，还提供大量的无机盐及生长因子。微生物早期容易利用无机氮，中期菌体的代谢酶系已形成有机氮源。有机氮源来源不稳定，成份复杂，所以利用有机氮源时要考虑到原料波动

23、对发酵的影响。三、无机盐（inorganic mineral） 硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。四、生长因子（growth factor）微生物生长不可缺少的微量有机物质。如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素。生长因子不是所有微生物都必需的。只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型（biotin auxotroph）,以生物素为生长因子。1.生物素作用: (1)主要影响细胞膜通透性。p263（2）影响菌体的代谢途径。生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累均有影响。大量合成谷氨酸所需要的生物素

24、浓度比菌体生长的需要量低，即为菌体生长需要的“亚适量”。生物素过量：菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸。生物素不足：菌体生长不好，谷氨酸产量也低。 -谷氨酸产生菌为生物素缺陷型。 -要达到菌体生长需要的“亚适量”。生物素存在于动植物组织中，多与蛋白质呈结合状态存在。用酸水解可以分开。那么，生产上有哪些原料可以作为生物素来源呢？2.提供生长因子的农副产品原料（1）玉米浆：（corn steep liquor, csl） 最具代表性。虽然主要用作氮源，但含有乳酸，少量还原糖和多糖，含有丰富的氨基酸，核酸，维生素，无机盐等。常作为提供生长因子的物质。所以，从某种意义上说，玉米浆液用于配制发酵培养基是发酵

25、工业中的一个重大发现。（2）麸皮水解液：可代替玉米浆，但蛋白质，氨基酸等营养成分比玉米浆少。（3）糖蜜：两种糖蜜（cane molasses，beet molasses）均可代替玉米浆。但氨基酸等有机氮含量较低。（4）酵母：可用酵母膏，酵母浸出液或直接用酵母粉。第二节 淀粉水解糖的制备 在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（glucose）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。其主要糖分是葡萄糖。根据水解条件不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其它一些二糖，低聚糖等复合糖。一、淀粉水解制糖的意义1.大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料

26、，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。二、淀粉水解糖的制备方法及原理（一）酸解法（acid hydrolysis method） 以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。1.水解过程：总反应式： (c6h10o5)n+nh2o nc6h12o6过程：(c6h10o5)n (c6h10o5)x c12h22o11 c6h12o6葡萄糖 淀粉 糊精 麦芽糖 h+对作用点无选择性，a-1,4-糖苷键和a -1,6-糖苷键均被切断。2.葡萄糖的复合反应和分解反应在水解过程中，由于受到酸和热的作

27、用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。 淀粉 盐酸 复合反应 葡萄糖 分解反应 复合二糖 5羟甲基糠醛 复合低聚糖 有机酸、有色物质损失葡萄糖量 7 1不利影响：（1）降低了葡萄糖的收率。（2）给产物提取和糖化液精制带来困难。复合反应：葡萄糖分子间经1，6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味），异麦芽糖和其它低聚糖(复合低聚糖)。生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。分解反应：生成的5羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。如何控制分解反应和复合反应的发生？（1）淀粉乳浓度（2）酸浓度 都不能过高（3）温度3.评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。

28、缺点：（1）副产物多，影响糖液纯度，一般de值(葡萄糖值)只有90左右。（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。de值：dextrose equivalent value （葡萄糖当量值） 表示淀粉糖的含糖量。 还原糖含量（）de值 - 100 干物质含量（）（二）酶解法（enzyme hydrolysis method） 用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。分两步：（1）液化：用a-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精和低聚糖转化为葡萄糖。 所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法(double e

29、nzyme hydrolysis method)。液化（liquification）淀粉酶水解底物内部的1,4糖苷键，不能水解1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。8590。淀粉的糊化与老化：由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强，需要先加热淀粉乳，使淀粉颗粒吸水膨胀，糊化，破坏结晶性结构。糊化：淀粉受热后，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，互相接触变成糊状液体，即使停止搅拌，淀粉也不会再沉淀的现象。老化：指分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用，必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。液化程度的控制（液化

30、后需糖化的原因）：如果让液化持续下去，虽然最终产物也是葡萄糖和麦芽糖，但：a.糖液的de值低（-淀粉酶不能水解-1,6糖苷键）b.液化在较高温度下进行，液化时间加长，一部分已液化的淀粉又会重新结合成硬束状态，老化，使糖化酶难以作用。c.液化的目的是为了给糖化酶的作用创造条件，而糖化酶水解糊精及低聚糖等分子时，需先与底物分子生成络合结构，然后发生水解作用，这就要求被作用的底物分子有一定的大小范围才有利于糖化酶生成这种结构，底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度。根据生产经验，de值在20-30之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。p25液化到终点后，为了避免液化酶对糖化酶的影响，需

31、对液化液进行灭酶处理，升温到100，保持10分钟，降温，供糖化用。2. 糖化（saccharification） 糖化酶从非还原性末端水解-1,4糖苷键和-1,6糖苷键。终点确定：de值达最高时（de值不再上升时），停止酶反应（加热至80，20min灭酶）。否则 de值将由于葡萄糖经-1,6糖苷键起复合反应而降低。糖化的温度（50-60）和ph值（4.0-5.0）决定于所用糖化剂的性质。3.评价优点： （1）反应条件温和，不需高温、高压设备。（2）副反应少，水解糖液纯度高。（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。（4）糖液颜色浅，质量高。缺点：（1）生产周期长，一般需要48小

32、时。（2）需要更多的设备，且操作严格。（三）酸酶结合法（acid-enzyme hydrolysis method） 集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分： 1.酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用-a淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。2.酶酸法：先用-a淀粉酶液化，再用酸水解。适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。或者小的水解，大的未水解；或者大的水解，时间长，小的则发生复合反应。 （四）不同糖化工艺的比较项目酸解法酸酶结合法酶解法de值919598羟甲基糠醛

33、（）0.30.0080.003色度100.30.2淀粉转化率909598工艺条件高温加压高温加压常温过程耗能多多少副产物多中少生产周期短中长设备规模小中大防腐要求高较高低适合发酵工艺情况差中有利第三节 糖蜜原料糖蜜是很好的发酵原料，用其生产，可降低成本，节约能源，便于实现高糖发酵工艺，但有些成分不适合发酵，必须进行预处理。一、糖蜜的分类及组成 含糖量 含氮量1.分类： cane molasses 高 低 beet molasses 低 高raw sugar molasses 精制粗糖时分离出的糖蜜 high test molasses( 高级糖蜜 ) glucose molasses 葡萄糖工

34、业不能再结晶葡萄糖的母液2.组成：粘稠、黑褐色、半流动状液体。组成各不相同。除含有发酵性糖分外，还含有胶体物质，灰分，维生素，氨基酸。甘蔗糖蜜中生物素含量较甜菜糖蜜中高。(国外大多以糖蜜为原料生产谷氨酸。二、糖蜜的预处理：胶体(产生大量泡沫)和灰分影响菌体生长及产品纯度。1.澄清：加酸，加絮凝剂（石灰）2.脱钙：加na2co33.降低生物素含量（谷氨酸发酵中）（1）去除生物素：活性炭及树脂吸附（2）拮抗生物素：加表面活性剂（tween 60），阻止油酸合成磷脂合成不足。（3）加青霉素：使新增殖的子细胞不具有完整的细胞壁，改善了细胞膜的渗透性。 另外，从菌种方面：使用油酸或甘油缺陷型，不受培养基

35、中高生物素的影响。第五章 培养基灭菌与空气净化 第一节 培养基灭菌一、灭菌的原理和方法 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）的区别？ 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢或非病源微生物。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。包括全部病源和非病源微生物。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。

36、 无菌：不存在活的细菌。为防止杂菌的污染，哪些需要灭菌？ 培养基，发酵设备，空气，菌种制作关于灭菌和消毒的不正确的理解是（ ） a灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子 b消毒和灭菌实质上是相同的 c接种环用灼烧法灭菌 d常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法防腐（antisepsis）防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （4）高渗 （2）缺氧 （5）高酸度 （3）干燥 （6）防腐剂除菌的方法 -培养基的加热灭菌-空气的过滤除菌-紫外线或电离辐射-化学药物灭菌 1.化学试剂灭菌法 方式：浸泡，添加，擦拭，

37、喷洒，气态熏蒸甲醛、乙醇、过氧乙酸、酚类（苯酚）或新洁尔灭、高锰酸钾等 高锰酸钾：氧化 0.1%-0.25%漂白粉：氧化，对细菌和phage均有效，是发酵工业中最常用的化学杀菌剂。75%酒精：杀菌作用在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.电磁波、射线灭菌法电磁波、紫外线或放射性物质。以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室，培养间等空间的灭菌。波长在260nm左右灭菌效率最高。适用范围：无菌室、接种箱3.干热灭菌法 细胞的氧化作用是导致死亡的主要依据。由于微生物对干

38、热的耐受力比对湿热强的多，故干热所需温度高，时间长，一般160-170，1-1.5h.(对要求保持干燥的物品可用)常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿4.湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min 热能使蛋白质变性。由于蒸汽有很强的穿透能力，来源方便，灭菌可靠，是常用的方法。适用范围：生产设备及培养基灭菌5.过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物 。适用于澄清液体和气体的除菌。适用范围：制备无菌空气 6.火焰灭菌法 方法简单，灭菌彻底，但适用范围有限。适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（ ）a高压蒸汽灭菌b高温灭菌c加

39、入抗生素灭菌d酒精灭菌二、培养基的湿热灭菌 湿热灭菌原理蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。 灭菌条件：121，30min。 灭菌不利方面：同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。（一）间歇灭菌 （常用）又称分批灭菌，是将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌或实消。过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况：图（二）连续灭菌（又称连消） 将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温

40、和冷却而进行灭菌。 连续灭菌的基本设备有哪些 ？配料罐泵加热塔维持罐冷却管发酵罐连续灭菌的流程与设备（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70 c ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126-132c ）；（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持5-7min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4）冷却管，使料液冷却到40-50c后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。 连续灭菌过程中温度的变化(虚线) ：由图可看出连续灭菌可在短时间内加热到保温温度，由于灭菌温度很高（比间歇灭菌高），保温时

41、间可相应缩短，有利于减少培养基中营养损失。 （三）间歇灭菌与连续灭菌的比较优 点缺 点连续灭菌1.高温短时灭菌，培养基 营养成分损失少。2.发酵罐占用时间缩短， 利用率高。3.灭菌质量稳定，提高了热利用率。1.设备复杂，操作麻烦, 染菌机会多。2.不适合含大量固体物 料的灭菌。间歇灭菌1.设备要求低，不需另外 加热、冷却装置。2.操作要求低，适合小批 量生产规模3.适合含大量固体物料的 灭菌1.培养基的营养物质损 失大，灭菌后培养基 质量下降2.发酵罐的利用率较低3.不适合大规模生产的 灭菌4需反复加热冷却，能耗较高。罐头食品在很长时间内不会腐败变质,是因为( )。 a.罐头密封很严，细菌无法

42、侵入 b.罐头密封很严，细菌无法呼吸 c.罐头在封罐前经过高温高压灭菌，封罐后罐内没有细菌 d.罐头在封罐前经过高温高压灭菌，封罐后罐内细菌无法生存第二节 空气净化（除菌）发酵对空气无菌程度的要求： 一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为n=10-3。-空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103 104个米3。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。-灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.61m）。一、空气除菌的方法 （一） 辐射杀菌：紫外线，、射线，使dna分子产生胸腺嘧啶二聚体，导致细胞死亡，一般可用于无菌室，手

43、术室杀菌。（二） 热杀菌：将空气加热到一定温度后保温一定时间，使微生物蛋白质（酶）氧化而致死。（培养基灭菌利用的是蛋白质的凝固）。热杀菌是有效的，可靠的杀菌方法，但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气，以达到杀菌目的是十分不经济的。工业上是利用空气压缩时放出的热量进行杀菌。（三） 静电除菌：利用静电引力来吸附带点粒子而达到除菌除尘的目的。悬浮于空气中的微生物，微生物孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都会被电离成带电微粒。对于一些直径很小的微粒，所带电荷很小，所以静电除菌对很小的微粒效率很低，迄今为止这种方法在无菌空气制备中并不多见。（四） 过滤除菌 ：是目前工业上最常用

44、的获得大量无菌空气的方法。二、空气过滤除菌的原理与介质： 原理：使空气通过高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒拦截在介质层中达到除菌的目的。 1.过滤除菌的种类绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。 孔径0.3 m，菌体大小一般为0.5 -5m 。如聚乙烯醇缩甲醛树脂（pvf）制成的mm0.3 的微孔滤膜。纤维素，聚四氟乙烯，聚乙烯醇缩甲醛树脂经热处理后均可作为过滤介质。一般用于医疗及特种发酵。深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。2.深层介质过滤的原理 微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向

45、的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。 目前工厂和实验室大多采用该方法。3. 空气过滤除菌介质（）纤维状或颗粒状过滤介质-棉花：常用（脱脂棉），有弹性，纤维长度适中，填充密度130-150kg/cm3。-玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好,填充密度130-280kg/cm3。-活性炭：要求质地坚硬，颗粒均匀。常用小圆柱体的颗粒活性碳。对0.3 m以下颗粒的过滤效率仅为99% ，需多次过滤。 缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。介质灭菌和吹干耗用大量蒸汽和空气。（）纸类过滤介质玻璃纤维

46、纸属于深层过滤技术。 纤维间空隙约为1-1.5m，将3-6张叠在一起使用，过滤效率高，压降小。对0.3 m以上颗粒的过滤效率为99.99% ，而且阻力小，压力降较小。 缺点：强度不大（特别是受潮后）。可在纸浆中加7-50%的木浆或其他化学处理。（3）微孔滤膜类过滤介质 空隙0.5m发酵生产中制备无菌空气的大致过程 ：空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热 总过滤器 分过滤器 无菌空气 空气预处理 空气过滤除菌流程分析：要有一系列冷却，分离和加热设备保证空气的相对湿度在50%-60%的条件下过滤。 三、空气的预处理 目的：-提高压缩前空气的洁净度-去除压缩后空气中的油和水1. 提高压缩前空气的

47、洁净度措施：（1）提高空气吸气口的位置（高度每上升10m,空气中微生物量下降一个数量级）（2）在空气入口处设置粗过滤器 （或前置高效过滤器） 捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机。高空取气管 -为远离地面几十米的管子。-每升高10米，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。 高效前置过滤除菌流程高效前置过滤器压缩机贮罐冷却器 丝网分离器加热器过滤器 2.空气压缩和压缩空气的冷却（1）空气压缩：克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。用空压机：涡轮式，往复式。（2）压缩后空气温度显著上升，需冷却。因为若直接通入过滤器会：-压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧-

48、增大发酵罐的降温负荷-增加培养液水分的蒸发 一般用列管式冷却器进行冷却。还有翅板式换热器。空气贮罐（结构图）-消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力。-利用重力沉降作用除去部分油雾。-紧接空压机安装。-有些装有冷却管。3. 压缩空气的除油除水 冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。两类设备：旋风分离器利用离心力进行沉降，对于mm10以上的微粒分离效率较高。丝网分离器利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去2mm5的细小颗粒。p251采用惯性拦截等机理，有效去除空气中的水、油雾、尘埃，不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。4.空气的加热 压缩空气冷却除去油和水后，空气的相对湿度仍为100

49、%。若不加热，只要温度稍有降低，可再度析出水分，使过滤介质受潮。所以将除油水的空气加热（温差在1015c 左右），降低相对湿度（达50%60%）后，输入过滤器。 用列管换热器。空气过滤除菌设备流程粗过滤 空压机 储罐 二级冷却 加热器 空气过滤四、空气过滤器过滤除菌的关键设备（结构图：介质层过滤器和超细玻璃纤维纸过滤器）180m3发酵罐车间大型空气压缩机发酵车间的空气过滤器空气净化的流程-吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤-进入空气压缩机（120-150c）-冷却（20-25c），除去油、水，再加热至30 -35c。-最后通过总过滤器和分过滤器，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气

50、。第六章 发酵工艺过程控制 第一节 发酵的操作方式一、 分批培养（batch culture or fermentation）又称分批发酵，常用的培养方法。1.概念：在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。分批培养中微生物的生长图迟滞期 对数生长期 稳定期 死亡期2.特点：(1)整个培养系统与外界没有其它物质交换（o2、co2、消泡剂、酸碱除外）(2)整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度不断变化，是一种非稳态的培养方法。即：在发酵罐中完成微生物生长的四个阶段：lag phase, log phase ,s

51、tationary phase, decline phase 或death phase3.分批培养的优缺点优点: 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握。缺点: 产率低。二、连续培养（continuous culture）1. 概念： 微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中不断添加新鲜的培养基，同时不断放出代谢物，使微生物细胞在近似恒定状态下生长的培养方式。2. 特点：最大特点是：微生物细胞的生长速率，产物的代谢均处于恒定状态，有效地延长对数期到稳定期的阶段，可达到稳定，高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的，菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度均处于恒定状态。3. 连续培养

52、的优缺点优点: 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，产量高。缺点: 长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。染菌机会增加。与分批培养比较：优点：连续运行，生产周期短，提高了设备利用率和生产效率。便于自动化控制，产品质量稳定。缺点：连续操作，设备复杂，易受杂菌污染。收率和产物浓度低，不利于提取。营养物质利用率低，增加了生产成本。需要复杂的检测，控制系统。易受菌种退化的影响。应用：废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业中。因此，连续培养在工业生产上并不多见，只局限于酒精，单细胞蛋白，丙酮，丁醇等少数几个产品。在生产实践中，完全封闭式的分批培养或者纯粹的连续培养较少见，更多见的是两者的折中形式：补料分批培养。三、补料分批培养（fed-batch culture） 介于分批培养和连续培养之间的操作方法。1.概念：根据菌体生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。(克服营养不足，体积有