刀豆素a诱发小鼠急性肝损害模型的形态改变及fas和fasl的表达.

1、刀豆素 a 诱发小鼠急性肝损害模型的形态改变及 fas 和 fasl 的表达材料和方法一、实验材料（一）实验动物 雄性balb/c小鼠，812周，体重2027 g，第二军医 大学动物中心提供。（ 二） 主要试剂 con a: 美国 sigma 公司；兔抗鼠 fas 单抗及 fasl 单抗： 美国 santa cruz 公司；羊抗兔 igg ：上海医学化学检验所； lsab 试剂盒：丹麦 dako 公司提供。二、实验方法（一）小鼠急性肝损害模型的建立 将balb/c小鼠随机分成五组，a组（对 照组）以0.25 ml注射用生理盐水代替，b、c、d、e组分别以每公斤体重10 40 mg con a

2、的剂量，以 0.25 ml 生理盐水充分溶解后尾静脉一次性注入， 8 h 后摘眼球放血，以 2 500 r/min 离心 20 min 后取血清待检，脏器用中性缓冲福 尔马林液固定。（ 二 ） 组织病理学检查 1. 肝脏等组织普通病理：常规 he 染色，对 a、b、 d 三组用病理指标评定肝损程度，病理指数的确定：在高倍镜下每次取 20 个视野，每一视野分三等份；“ 0”记整个视野无肝细胞病变；“ 1”记肝细胞 发生病变1/3视野；“2”记肝细胞发生病变 1/32/3 视野；“ 3”记肝细胞 发生病变2/3视野；20个视野得分相加即为肝细胞的病理指数 pi 值。2.链酶 亲合素标记的辣根过氧化

3、物酶显色法 （s-p 法）观察肝组织 fas 及 fasl 表达：（1） 肝组织 fas 表达：石蜡切片经二甲苯脱蜡至水，充分洗涤，微波抗原修复后冷 却至室温，以 lsab 试剂盒免疫组化检测，按说明操作。依次用正常兔血清 （阻 断）、兔抗鼠 fas 单抗（反应） 、生物素羊抗兔 igg（ 连接） 、过氧化物酶 -链酶亲 合素反应，二氨基联苯胺 （dab） 显色后，苏木素衬染。 （2） 肝内 fasl 的表达检 查：与检测 fas 相同的免疫组织化学技术，改用兔抗鼠 fasl 单抗，以氨基乙基 咔唑显色。 （3） 实验对照：阴性对照：用 pbs 替代第一抗体设空白对照；用正 常兔血清替代第一抗

4、体设替代对照。阳性对照：用已知表达 fas 及 fasl 的淋巴 结为对照。 （4） 结果判定：阳性物质呈棕黄色，分布于胞膜和胞浆中，胞核经苏 木素衬染为淡蓝色。（ 三） 丙氨酸转氨酶 （alt） 测定 赖氏法。三、统计学处理t 检验， f 检验，相关分析。结果一、不同剂量 con a 作用 8 h 后 alt 表达水平在实验中观察到 con a 30 mg/kg 及 40 mg/kg 用量组在用药后 6 h 左右出 现少动，抓之无反抗，肢体逐步发凉，放出的血，血凝块收缩不良等， d 组在 7 h 死亡 1 只。各组测定的 alt 结果如表 1 所示。以 con a 剂量为变量，以 alt 为

5、应变量的相关分析显示两者呈显著的正相关，相关系数 r=0.59（p=0.002） ， 说明肝功能的损害对 con a 具有剂量依赖性。二、组织病理学观察（ 一） he 染色 心、肺、肝、肾、脾等脏器 he 染色结果显示只有肝组织有 明显的损害。不同程度地表现为肝小叶结构欠清晰，肝细胞肿胀、变性，肝窦 及中央小静脉淤血，部分肝细胞内有大的脂肪空泡形成，胞浆透亮，核固缩， 小灶性坏死多见，肝内小血管中可见到较多的炎性细胞集聚。此外，单个肝细 胞嗜酸性变非常普遍。用病理指数作为肝损的量化指标，b、d 组分别为：41.5 9.2、45.5 7.8，随着con a剂量的加大，pi有上升趋势，与对照a组

6、10 4.2 差异有显著及非常显著性。表 1 不同剂量 con a 处理后小鼠血清 alt 表在水平 组别 con a 量(mg/kg)实验只数 死亡数 alt(u/l) a 0 6 0 62 19b 10 6 0 1 405 807*c 20 6 0 3 182 1 494*d 30 7 1 8 933 4 076*e 40 7 0 10 229 9 071*注：alt 值为土 s *p0.01（ 二） 免疫组织化学 fas 在对照组和 con a 处理组肝细胞表面及肝窦内皮 细胞表面均有表达，但 con a 处理组比较显著 ;fasl 只表达于 con a 处理组肝 组织中，靠近中央静脉的

7、肝细胞内表达明显。讨论con a 在体外能刺激 t 细胞分裂并释放各种细胞因子，诱导淋巴细胞和巨 噬细胞的细胞毒性是其生物学特性之一。本实验在无需致敏的情况下用尾静脉 一次性注射一定剂量 con a 的方法成功地建立了纯种 balb/c 小鼠特异性肝损害 模型。通过 con a 注射剂量与血清 alt 表达水平的相关分析及病理指数的观 察，提示在一定范围内肝损程度与 con a 剂量有显著的正相关。通过对 con a 处理组 balb/c 小鼠主要脏器的病理观察显示，只有肝组织有 明显的损害，不同程度地表现为肝细胞肿胀、变性，坏死，肝内小血管中可见 到较多的炎性细胞集聚。此外，单个肝细胞嗜酸性

8、变非常普遍。免疫组织化学 检查显示 fas 在对照组的 balb/c 小鼠肝组织中有表达，这与文献报道一致，而 con a 处理组肝组织中 fas 表达尤为明显，在肝细胞及肝窦内皮表面多见。 fasl 只表达于 con a 处理组肝组织中，靠近中央静脉的肝细胞内呈强阳性。con a 诱导特异性肝脏损害的原因尚不清楚。 gantner 等 3观察到 cona只聚集在肝窦内皮细胞表面。con a对肝脏的特异性损害尚取决于t淋巴细胞 的激活，并依赖于与巨噬细胞的互相作用。电镜还观察到淋巴细胞与肝细胞紧 密接触的现象4。keren等5认为con a可能起到替代抗原提呈细胞提 呈的mhc-ii类分子结合

9、的多肽抗原的作用。近年的研究认为，肝脏的结构特异 性-肝细胞和库普弗细胞的紧密接触，使其实质细胞与免疫细胞不必通过体液循 环而相互作用，这可能增加了作用的直接性和强度而较别的脏器更容易遭受免 疫攻击。本实验的结果显示肝实质细胞是con a毒性的靶细胞，con a在体内可能亦能通过诱导t细胞及巨噬细胞的细胞毒性，进一步分泌某些细胞因子发 挥作用。此外，小鼠的淋巴细胞、肝细胞、胆管细胞，内皮细胞广泛地分布着 fas 6，而活化的t淋巴细胞，尤其是cd + 8ctl细胞及cd + 4th1 亚群可表达fasl 7，因而con a可能通过激活t淋巴细胞表达fasl,以可溶 性fasl的形式诱导肝细胞凋亡。既往认为只有成熟t细胞表达fasl o galle等8首次在酒精性肝病肝细胞表面检测到fasl，并提出了“细胞自杀”及“同胞相杀”的假设。本实验初步观察到con a处理组肝细胞内有fasl表达，提示表达fasl的肝细胞可能充当效应细胞，引起“细胞自杀”及“同胞相杀” 的可能。刀豆素a(concanavalin a, con a)在体外可刺激t细胞进行有丝分裂，并释放细胞因子，诱导淋巴细