水稻抽穗期QTL DTH2的图位克隆和功能分析

1、水稻抽穗期 qtl dth2 的图位克隆和功能分析吴玮勋1，江玲1，钟铮铮2，陆广文1，万建民1*51015202530（1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）摘要：开花时间（作物中指抽穗期）是决定生长季节和植物适应特定自然环境的地区适应性的重要生态性状。水稻是起源于热带地区的短日作物。本文鉴定了一个在长日照条件下促进抽穗的微效数量性状位点 dth2，并对其进行了分子克隆。互补和 rna 干扰实验证实 dth2编码一个 constans-like 蛋白。dth2 蛋白定位在细胞核内并具有转录自激活活性，并

2、且dth2 的表达受节律钟调控。我们发现通过诱导成花素基因 heading date 3a (hd3a) 和 riceflowering locus t 1 (rft1) 来促进抽穗，并且独立于已知的开花集成子 heading date 1(hd1) 和 early heading date 1 (ehd1)，体现了微效 qtls 在作物育种中起重要作用。关键词：水稻；dth2 克隆；抽穗期；功能分析中图分类号：s511.s330.2+5map-based cloning and function analysis of qtl dth2 forheading date in rice (or

3、yza sativa l.)wu weixun1, jiang ling1, zhong zhengzheng2, lu guangwen1, wan jianmin1(1. state lab of crop genetics and germplasm ehancement, nanjing agricultural university,nanjing 210095;2. cro science institute, caas, beijing 100081)abstract: flowering time (heading date in crops) is an important

4、ecological trait that determinesgrowing seasons and regional adaptability of plants to specific natural environments. rice (oryzasativa l.) is a short-day plant that originated in the tropics. we report here the molecular cloningand characterization of dth2, a minor-effect quantitative trait locus (

5、qtl) that promotes headingunder long-day conditions (lds). complementary test and rna interference assay confirmed thatdth2 encodes a constans (co)-like protein. dth2 protein is targeted to the nucleus and hastranscriptional activation activity and dth2 expression is regulated by the circadian clock

6、. weshow that dth2 promotes heading by inducing the florigen genes heading date 3a (hd3a) andrice flowering locus t 1 (rft1), and it acts independently of the known floralintegrators heading date 1 (hd1) and early heading date 1 (ehd1), demonstrating an importantrole of minor-effect qtls in crop ada

7、ptation and breeding.keywords: rice; dth2 cloning; heading date; function analysis350 引言成功的现代农业依赖于作物更好地适应于当地的环境和栽培范围的扩张，主要取决于合适的开花时间（在水稻中开花时间指抽穗）1。光周期敏感性使营养生长和生殖生长适应当地的气候被认为是使作物适应特异的生态条件和环境变异从而决定开花时间的最重要的因40子1,2。在合适的生长条件下，延迟抽穗使作物拥有更长的营养生长期，从而促进更多资源的积累和分配至种子生产，然而短的或不可预知的生长季节则对生育期短的物种有利3。资源分配和压力避免之间的权

8、衡对于作物的产量和质量是特别重要的3。利用拟南芥（长日照植物）和水稻（短日照植物），开花时间的分子机制已经进行了深基金项目：教育部博士点基金（20090097110011）作者简介：吴玮勋，（1985-），男，博士研究生，水稻分子遗传学。通信联系人：万建民，（1960-），男，教授，水稻遗传育种。e-mail: -1-入的研究。在对拟南芥的开花相关研究发现有四种主要途径参与开花调控，分别是光周期途4550556065707580径，春化途径，自主开花途径和赤霉素途径4，其中最重要的是光周期途径。在拟南芥中，gigantea (gi) constans (co)

9、flowering locus t (ft)是一条主要的长日照促进开花通路5-10，这些基因在水稻中分别有相应的同源基因，组成水稻中的促进开花的通路为osgihd1hd3a11-15。与拟南芥不同，该通路在水稻中仅在短日照下促进开花，因为在长日照条件下，hd1 抑制 hd3a 的表达，导致开花延迟14。目前的研究表明水稻的抽穗由 hd3a（水稻短日照下的主要成花素）和 rft1（hd3a 的同源基因，水稻长日照下的主要成花素）促进16,17。在这些成花素基因的上游基因中，hd1和 ehd1 作为两个主要的开花信号集成者，接受来自其它基因的多种信号，如 osgi, rid1,ehd3, osma

10、ds50, osmads51, ghd7, 和 dth8，来调控成花素基因的表达2,12,14,18-27。这些开花时间基因的克隆为进一步深入了解水稻的开花途径具有重要的借鉴意义。在本研究中，我们克隆了一个微效 qtl，dth2，在 ld 下诱导开花而在 sd 下没有效应，研究发现该基因对于促进水稻在长日照下开花起重要作用。1 材料与方法1.1 水稻材料和生长条件以 asominori（aso，粳稻）为背景亲本和 ir24（籼稻）为供体亲本的染色体片段置换系 cssl23，携带有来源于 ir24 的 dth2 基因。为了进一步减少 cssl23 中的来自 ir24 的插入片段，我们筛选出了一个

11、以 aso 为背景，包含 dth2 位点的 9.6-cm（厘摩）来自 ir24片段的 nearly isogenic line (nil)。该 ir24 片段限定于第二染色体 ssr 标记 rm318 和 rm240之间。aso 和 nil 种植在北京自然长日照条件(natural long-day conditions, nlds, 116.4 e,39.9 n, day length 15 h), 海南自然短日照条件(natural short-day conditions, nsds, 110.0e, 18.5 n, day length 15 h），和 aso 比相比，nil 延迟 7

12、.4 天抽穗，但在海南自然短日照条件下（nsds，日长12 h）差异不显著（图 1a,b）。在受控制的长日照条件下(clds，14 h light/10 h dark) nil也比 aso 晚抽穗，而在受控制的短日照条件下(csds，10 h light/14 h dark)差异也不显著（图1b）。另外我们发现在 nlds 下，当种子收获的时候，有 81.5%的 aso 种子能成熟，而只有28.6%的 nil 种子能成熟，71.4%的种子都是青的。相反的，在 nsds 下，收获后所有来自aso 和 nil 的种子都能成熟（图 1c,d）。这些结果也证明来自 aso 的等位基因能更好地适应 nl

13、ds 以形成生殖适应。遗传分析表明，aso 和 nil 杂交形成的 f2 群体中早抽穗和晚抽穗的分离比大约为 3:1（3213:1099, 2 = 0.55, p = 0.46），表明 dth2 是一个单孟德尔因子。我们用 f2 衍生家系（f2:3）的平均表型值来鉴定抽穗期，我们选择了 1099 个晚抽穗的纯合家系，最终将 dth2 定位在 dcaps3 和 dcaps5 之间的 37.6kb 的区间内（图 1e）。图1 两个亲本的表型和dth2的图位克隆。（a）aso和nil在北京nlds下的表型，照片拍摄于aso抽穗的时候。（b）两个亲本在四种不同条件下的抽穗期。数据用平均值标准误差显示。

14、（c）nlds下，aso抽穗后60天时收获的来自aso和nil的糙米。（d）aso和nil在nlds和nsds下的种子成熟百分率。（e）dth2的图位克隆。底部显示dth2编码区结构及aso (dth2-a)和nil (dth2-i)等位基因之间的自然变异。长方形和线分别代表外显子和内含子。p代表双尾t测验的p值，实验所用的植株数显示在柱子中。数据用平均值标准误差显示。fig. 1 phenotypes of the parental lines, map-based cloning of dth2. (a) the phenotype of aso and nil under nlds in

15、 beijing.photo was taken at the aso heading stage. (b) days to heading of the parental lines under four different conditions. (c) thebrown rice of aso and nil from panicles sampled 60 days after aso heading under nlds. (d) seed maturity percentage of asoand nil under nlds and nsds. (e) map-based clo

16、ning of dth2. the bottom diagram shows the coding region structure ofdth2 and natural variation between the aso (dth2-a) and nil (dth2-i) alleles. rectangles and lines represent exons andintrons, respectively. p represents p value from two-tailed t-test. numbers of the plants used in the study are i

17、ndicated in thecolumns. data are presented as mean standard error (s.e.m.).-4-2.2 转基因功能验证150155160165170175为了证明 orf5 是目的候选基因，我们构建了一个包含 7867bp（包括 4049bp 上游序列，orf5 全长，1543bp 下游序列）来自 aso 的片段的载体 pdth2-a:dth2-a，转入 nil 中。我们进行了两次独立的转化，分别获得了 25 和 60 株独立的 t0 转基因植株，种植在北京 nlds下。通过转基因鉴定其中分别有 23 和 39 株转基因阳性植株。结果

18、显示和空载体相比，转基因植株的抽穗期明显提前。于是我们经过转基因拷贝数检测随机挑选两株单拷贝的 t0 植株，收种后种植成两个 t1 家系，随后我们又种植了两个纯合 dth2-a 转基因的 t3 家系（#18-7-2和#26-1-4），发现这两个家系的平均抽穗期比空载体提前，种子成熟度也比空载体显著提高（图 2a）。另外，我们构建了 rna 干扰（rnai）载体，准备干扰 aso 中的 dth2-a。经过转基因检测，我们找到了两个纯合的 t3 干扰家系（#5-4-2 和#38-37-4）。和空载体相比，转基因植株的抽穗期明显延迟，种子成熟度也明显降低，表型和空载体-nil (ev-n)相似（图2

19、b）。因此我们认为 orf5 就是 dth2。图2 t3互补和干扰转基因植株的表型和分子鉴定。t3转基因家系包括空载体-nil (ev-n)， 互补 (#18-7-2和#26-1- 4)，空载体-aso (ev-a)， 和 rnai (#5-4-2和#38-37-4) 在nlds下的照片（a），抽穗期（b）和种子成熟度（c）。p1 和p2分别表示互补和ev-n植株之间，rnai和ev-a植株之间的双尾t检验和wilcoxon符号秩检验。实验中用到的植株数在柱子中显示，数据用平均值标准误差显示。fig. 2 the phenotype and molecular identification o

20、f t3 transgenic plants of complementation and rnai. thephoto (a), days to heading (b), and seed maturity percentage (c) of t3 transgenic lines including emptyvector-nil (ev-n), complementation (#18-7-2 and #26-1-4), empty vector-aso (ev-a), and rnai (#5-4-2 and#38-37-4) under nlds. p1 and p2 indicat

21、e two-tailed t-test and wilcoxon signed-rank test results between co-mplementation and ev-n plants, rnai and ev-a plants, respectively. numbers of the plants used in the study areindicated in the columns. data are presented as mean standard error (s.e.m.).2.3 dth2 的亚细胞定位和转录自激活活性分析为了确定 dth2 蛋白的亚细胞定位，

22、我们融合了 dth2-a 的全长 cds 和 gfp，dth2-a-gfp 融合蛋白和一个核标签共定位在水稻叶片原生质体中（图 3a-d）。说明 dth2蛋白定位在细胞核中。进一步，转录自激活活性实验表明 dth2 在酵母中有很强的转录自激活活性（图 3e）。缺失分析表明存在于锌指结构域和 cct 结构域中间的区域对于转录活性是必须的（图 3e）。这些结果表明 dth2 在细胞核中的基因表达调控中存在重要作用。-5-180185190195200205210图3 dth2的亚细胞定位。（a）dth2-a-gfp融合蛋白在细胞核中，（b）核标记（osmads3-mcherry），（c）明场，（d

23、）融合图片。比例尺为7.5 um。（e）dth2在酵母的gal4系统中的转录自激活活性实验和缺失分析。bd是gal4-dna结合结构域；zf，mr和cct分别表示dth2的锌指区域，中间区域和cct结构域；ev表示空载体负对照。-半乳糖(-gal)活性通过液体培养的方法测定。数据用平均值标准偏差显示，三次独立实验。fig. 3 subcellular localization of dth2. (a) dth2-a-gfp fusion protein in the nuclei, (b) a nuclear marker(osmads3-mcherry), (c) bright field,

24、 and (d) the merged image. scale bar represents 7.5 um. (e)transactivation activity assay of dth2 and its deletion derivatives in the yeast gal4 system. bd is gal4-dnabinding domain; zf, mr, and cct indicate the zinc finger region, the middle region, and the cct domain ofdth2, respectively; ev denot

25、es empty vector negative control. the -galactosidase (-gal) activity was measuredusing a liquid culture assay. the mean standard deviation (s.d.) was collected from three independentexperiments.2.4 dth2 的时空表达模式分析为了检测 dth2 的时间和空间表达模式，我们用实时定量 pcr（qrt-pcr）对来自 aso的各组织中检测 dth2 的表达水平。在所有组织中都检测到 dth2 的表达，但

26、在叶片和叶鞘中的表达最丰富（图 4a）。另外 qrt-pcr 的结果也表明 dth2-a 和 dth2-i 表现相似的表达水平和模式。在 clds 和 csds 下，它们的表达在黎明后 8 小时开始积累，黄昏后 2 小时达到高峰，之后开始降低（图 4b,c）。图4 dth2的时空表达模式分析。(a) dth2-a在自然长日照条件下的组织特异表达模式。在clds (b)和csds(c)下，dth2-a 和dth2-i 等位基因节律表达模式的qrt-pcr分析。开放和封闭的柱子分别代表光期和暗期。表达水平用水稻ubiquitin (ubq)基因作内参。数据用平均值标准偏差显示，三次技术重复和两次生

27、物学重复。fig. 4 the temporal and spatial expression pattern analysis of dth2. (a) tissue-specific expression pattern ofdth2-a under nlds. qrt-pcr analysis of the diurnal expression patterns of dth2-a and dth2-i alleles underclds (b) and csds (c). the open and filled bars represent light and dark periods

28、, respectively. the expressionlevel is shown as a ratio with the rice ubiquitin (ubq) gene. the mean s.d. was obtained from three technicalrepeats and two biological repeats.2.5 dth2 通过上调 hd3a 和 rft1 的表达来促进抽穗我们通过比较一些光周期相关基因在 aso 和 nil 之间的表达差异，发现在 clds 下，两个成花素基因 hd3a 和 rft1，在 aso 中的表达水平比在 nil 中的高，但在

29、csds 下几乎一致（图 5a,b,e,f）。相似的，仅在 clds 下，下游开花相关基因 osmads14 和 osmads15-6-在 nil 中的表达下降（图 5c,d,g,h）。215220225230随后我们检测 dth2 调控 hd3a 和 rft1 是否由 hd1 或 ehd1 介导，然而在 aso 和 nil之间 hd1 或 ehd1 的表达没有显著差异（图 6a,b）。另外，在携带有无功能的 hd1 或 ehd1等位基因的 nils 中，dth2 的表达与其在相应的野生型植株中的表达相似（图 7a,b）。这些结果表明 dth2 对于成花素基因的效应独立于 hd1 和 ehd1

30、。同理，其它 hd1 和 ehd1 的调节子，如 rid1/osid1/ehd2, ehd3, osmads50, osmads51,ghd7 和 dth8 的表达也不受 dth2 的影响（图 6a,b）。相似的，dth2 的表达也不受这些开花调节子的影响（图 7c-h）。因此，dth2 可能是一个新的在 ld 下诱导开花，独立于hd1 和 ehd1 的开花集成基因。图 5 在 clds (ad)和 csds (eh)下，hd3a，rft1，osmads14 和 osmads15 在 aso 和 nil 中节律表达模式的 qrt-pcr 分析。开放和封闭的柱子分别代表光期和暗期。表达水平用水稻

31、 ubq 基因作内参。数据用平均值标准偏差显示，三次技术重复和两次生物学重复。fig. 5 qrt-pcr analysis of hd3a, rft1, osmads14, and osmads15 diurnal expression patterns in aso and nilunder clds (ad) and csds (eh). the open and filled bars represent the light and dark period, respectively.the expression level is shown as the ratio with the

32、 rice ubq gene. the mean s.d. was obtained from threetechnical repeats and two biological repeats.-7-图 6 在 clds (a) 和 csds (b) 下，hd1，ehd1，rid1/osid1/ehd2，ehd3，osmads50，osmads51，ghd7和 dth8 在 aso 和 nil 节律表达模式的 qrt-pcr 分析。开放和封闭的柱子分别代表光期和暗期。表达水235240平用水稻 ubq 基因作内参。数据用平均值标准偏差显示，三次技术重复和两次生物学重复。fig. 6 qrt-

33、pcr analysis of hd1, ehd1, rid1/osid1/ehd2, ehd3, osmads50, osmads51, ghd7 and dth8diurnal expression patterns in aso and nil under clds (a) and csds (b). the open bars and the filled barsrepresent light period and dark period, respectively. the expression levels are shown as the ratio with the rice

34、 ubqgene. the mean s.d. was obtained from three technical repeats and two biological repeats.-8-图 7 在 clds 下，dth2 在各种开花时间 nils 和它们的野生型和相应的突变体中的表达水平。(a) 日本晴(nip, 包含有功能 hd1 等位基因)和 nil (hd1, 包含无功能 hd1 等位基因), (b) nil (ehd1, 包含有功能 ehd1等位基因) 和 t65 (ehd1, 包含无功能 ehd1 等位基因), (c)tohoku il9 和 ehd2 突变体, (d) toh

35、oku il9 和 ehd3245250255260265270275突变体, (e) dongjin 和 osmads50 突变体, (f) dongjin 和 osmads51 突变体, (g) nil(ghd7, 包含来自明恢 63的有功能 ghd7 等位基因)和 nil(ghd7, 包含来自珍籼 97 的无功能 ghd7 等位基因), (h) aso (包含有功能dth8 等位基因)和 cssl61 (dth8, 包含无功能 dth8 等位基因)。样品取自 49 天植株的次新叶，暗期后 2小时开始取样，取 3 株。表达水平用水稻 ubq 基因作内参。数据用平均值标准偏差显示，三次技术重

36、复和两次生物学重复。fig. 7 the expression levels of dth2 in various flowering-time nils or their wts and corresponding mutantsunder clds. (a) nipponbare (nip, with a functional hd1 allele) and nil (hd1, with a non-functional hd1 allele),(b) nil (ehd1, with a functional ehd1 allele) and t65 (ehd1, with a non-f

37、unctional ehd1 allele), (c)tohoku il9and ehd2 mutant, (d) tohoku il9 and ehd3 mutant, (e) dongjin and osmads50 mutant, (f) dongjin and osmads51mutant, (g) nil(ghd7, with a functional ghd7 allele from minghui63) and nil(ghd7, with a non-functional ghd7allele from zhenshan97), (h) aso (with a function

38、al dth8 allele) and cssl61 (dth8, with a non-functional dth8allele). penultimate leaves were collected 2 hours after the dark period from 49-d-old plants and three plants wereharvested. the expression levels are shown as the ratio with the rice ubq gene. the mean s.d. was obtainedfrom three technica

39、l repeats and two biological repeats.3 讨论本研究中，我们用图位克隆的方法克隆了 dth2 基因，研究表明 dth2 编码一个 co-like蛋白。co-like 基因家族成员在许多植物的光周期调控开花途径中起重要作用，而且在双子叶和单子叶植物中高度保守34,35。拟南芥和水稻基因组分别有 17 个和 19 个 co-like 基因34。有意思的是，之前的研究表明两个 co-like 基因，hd1 和 ghd7，在水稻中 ld 下负调控开花，然而 hd1 有另一个功能即在 sds 下促进开花12,25。另外，水稻 hd1/ghd7 在小麦和大麦中的同源物（

40、tahd1/vrn2 和 hvco1/hvvrn2）也参与开花调控36-39。进化分析表明 dth2 和拟南芥 col9 基因表现高度的序列一致性40。拟南芥 col9 在 lds 下通过抑制 co 和 ft 的表达从而抑制开花40，然而本研究中我们发现 dth2 在 lds 下促进水稻开花。因此，dth2和 col9 在水稻和拟南芥中可能通过不同的机制调控光周期开花。本研究中，我们发现在 lds 下，dth2 通过诱导 hd3a 和 rft1 表达来促进抽穗，但独立于两个开花集成基因 hd1 和 ehd1。因此，dth2 可能是一个新的开花集成子。一个来自台湾的栽培稻 t65 中的发现进一步

41、支持该现象，t65 同时包含无功能的 hd1 和 ehd1 等位基因但在 sds 和 lds 下都能抽穗18。我们发现 t65 包含 dth2-a 等位基因，并且在 ehd1 的nils 中 dth2 的表达水平没有差异（图 7b）。进一步，我们构建了 t65/nil f2 群体包含2000 个单株，从中分离出了 16 株 hd1/ehd1/dth2-i 三突变体，我们发现三突变体比 t65 抽-9-穗晚。因此，dth2 是一个新的开花集成子，独立于 hd1 和 ehd1 在长日条件下促进开花。关于这点，有意思的是最近在水稻中发现了另一个 co-like 基因 osco3 和开花相关，该基因在

42、 sds 下抑制开花。进一步研究发现该基因也独立于 hd1 和 ehd1，通过负调控 hd3a 来抑制抽穗41。2802854 结论本文鉴定了一个在长日照条件下促进抽穗的微效数量性状位点 dth2，并对其进行了分子克隆。互补和 rna 干扰实验证实 dth2 编码一个 constans-like 蛋白。dth2 蛋白定位在细胞核内并具有转录自激活活性，并且 dth2 的表达受节律钟调控。我们发现通过诱导成花素基因 heading date 3a (hd3a) 和 rice flowering locus t 1 (rft1) 来促进抽穗，并且独立于已知的开花集成子 heading date 1

43、 (hd1) 和 early heading date 1 (ehd1)，体现了微效 qtls 在作物育种中起重要作用。致谢感谢台湾中兴大学 tsai kuo hai 教授，韩国浦项大学 gynheung an 教授，日本国立农业生物科学研究所 masahiro yano 教授和华中农业大学张启发提供本研究中用到的各种材料。290参考文献 (references)1 yamamoto t, lin h x, sasaki t, et al. identification of heading date quantitative trait locus hd6 andcharacterization of its epistatic interactions with hd2 in rice using advanced backcross progeny. genetics, 2000,295300305310315320325154: 885-8912 tsunematsu h, yoshimura a, harushima y, et al. rflp framework map using