拟南芥ems诱变及突变体筛选课件

1、拟南芥ems诱变及突变体筛选,EMS诱变拟南芥,诱变方法： 称取250mg(约5000粒)野生型种子+25ml重蒸水50ml烧杯内搅拌30min4下放置12h30ml 100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)的100ml三角瓶中加入0.2%(v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)封口后放在水浴(25)振荡器上振荡12h50ml蒸馏水漂洗种子4次,每次15min将漂洗好的种子置4下春化3天后种植。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,诱变植株培养：,将经EMS诱变处理后的拟南芥种子(M1)播种于用1 /4Hoagland营养液浸透的混有蛭石的营养土中(营养土:蛭石=2:1, v/v),种植后覆盖塑料薄膜以

2、保持湿度。在温度1822、光照强度120mol/m2s-1、光暗周期16h/8h条件下培养,待种子成熟后分行采收种子(M2代)。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,100mmol/L磷酸缓冲液配置：,1、准备100ml 1M K2HPO4和100ml 1M KH2PO4; 2、将70ml K2HPO4和20ml KH2PO4在烧杯中混匀； 3、用KH2PO4将PH调到6.5； 4、将1M的磷酸缓冲液稀释到100mmol/L。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,突变体筛选,根据光合色素的改变来筛选叶色突变体 因为很多与光合作用相关的基因突变,会直接引起叶片颜色的改变。叶色变异是比较常见的突变性状,一般在

3、苗期表达,但少数突变体直到发育后期才发生叶色突变。由于基因突变往往是直接或间接影响叶绿素的合成和降解,改变叶绿素含量和叶绿素a/b的比值,所以叶色突变体也多为叶绿素突变体。叶色突变体的分类主要从苗期叶色来划分,如白化、黄化、浅色、黄绿、绿色、花斑叶。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,选择压的确定,适当的选择压力应当是既能使突变体的优势得到发挥,又能使野生型受到足够的压力而不能表现。在筛选突变体之前,首先要设计一系列的筛选浓度,以野生型完全不能生长的浓度确定为筛选浓度。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,根据高叶绿素荧光表型筛选突变体,其中高叶绿素荧光表型,作为光合电子传递链受损的标志,广泛地应用于筛

4、选光合组分功能缺失的突变体。在正常的条件下,光化学反应与非光化学途径活性很高,荧光的释放很低(约3一5%);相反,如果由于类囊体膜蛋白复合体结构的改变等原因而造成的光合电子传递的受阻,则所吸收的光能不能有效传递转变成化学能,便会以热或高荧光的形式释放出来,使光受体从激发态回到它的稳定态(基态),导致吸收的能量以红色荧光进行释放的比例增加,这样我们便能在暗室中观察到与正常植株所发出的暗红色荧光相比是亮红色的荧光,即产生高荧光(hcf)的表型从而将突变体筛选出来。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,根据叶绿素荧光参数筛选突变体,以叶绿素荧光参数为指标,可以得到不同类型的突变体,其中影响非光化学淬灭（N

5、PQ)和Psll的有效量子产率(ll)是两种主要类型的突变体。 突变体筛选： 接种:拟南芥种子用10%次氯酸钠浸泡15分钟,其间不时的振荡使灭菌充分,再用无菌水冲洗种子3次以上,灭菌处理后的种子点播于含3%的蔗糖的MS固体培养基(0.8%琼脂)上,接好的种子放在4冰箱里春化2天。 培养:于22下,光强120mol/m2sec(12h光照/12h黑暗)的光照条件下培养15-20天之后进行筛选。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,叶绿素荧光成像系统对突变体进行筛选，设定不同伪彩色参数挑选出Fo；Fm；Fv/Fm;NPQ变化的突变体。 室温状态下,暗适应后的突变体野生型各生长时期植株用于分析。,拟南芥e

6、ms诱变及突变体筛选,过程： 1、测量前，使植株暗适应至少30分钟； 2、打开测量光(measuring light,650nm的脉冲测量红光，脉冲频率为1.6KHz,光强0.05mol/m2 s)，得最小荧光值Fo； 3、得到稳定的初始荧光值Fo，施加0.8s的单饱和脉冲光(3000mol/m2 s); 4、1.5分钟后，曲线基本稳定，打开激活白光(actinic light，光强为40mol/m2 s); 5、7.5分钟时光合作用己达到稳定状态，曲线基本可以稳定，得到Ft，在激活光存在下打开单饱和光(a saturating flash of light,持续800ms,光强为6000mo

7、l/m2 s)脉冲一次，与此同时，测量光脉冲频率变为20KHz，得最大荧光值Fm。 6、等曲线回落下来并达到稳定，关闭激活光，再关闭测量光。记录Fo,比率(Fm一Fo）/Fm=Fv/Fm,光饱和曲线等。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,植物叶片经过充分暗适应后,PSI和PSll均处于还原状态，在650nm,光强为0.05-o.1mol/m2s的测量红光下，由于Psl主要吸收远红光，Psll主要吸收红光，此时叶片电子传递过程主要停留在PSll中，得到稳定的初始荧光值FO。施加单饱和脉冲(3000mol/m2 s for 0.8s)后，Psll暂时达到饱和，Psll的电子受体QA被完全还原，叶绿素荧光产量由基态F(o)上升到最大值F(m)。这可以决定PSll最大光化学量子产量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能转化效率。在拟南芥野生型叶片中,常在0.8-0.84之间。,拟南芥ems诱变及突变体筛选,1、当Fv/Fm比值在0.5左右时,说明在突变体中PSll内部的电子传递受阻或者突变体中部分PSll功能丧失的结果。这是由于Fo升高引起的。 2、当Fv/Fm比值高于