消毒剂消毒效力和有效期验证方案

1、湖北普爱药业有限公司验证管理标准文件第1页共5页消毒剂灭菌效果验证编号： PY-ZR-YZ-004-00起草：审核：批准：类别：技术标准日期：日期：日期：颁发部门： QA生效日期：年月日分发部门：验证委员会、质量管理部、生产管理部消毒剂的选用原则：目的：确认各洁净级别的操作间及设备外表面按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒、防止污染的目的，并在消毒剂有效期内能确保其消毒效力能符合要求。范围：本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。1. 参考文件1.1.医疗器械生产质量管理规范1.2.中国药典 2015 版

2、第 4 部 微生物限度检查法2.概述2.1.本公司的洁净区为 D 级，拟定用于洁净区表面消毒的有五种消毒剂：75%乙醇、 0.1%新洁尔灭溶液、 0.2%新洁尔灭溶液、 0.5%醋酸氯己定溶液、 0.1%己定溶液。本次验醋酸氯证方案将选用以上5 种消毒剂分别进行验证试验。作用对象一样的消毒剂每月轮换使用， 避免表面微生物产生耐药菌株。 在利用消毒剂进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10 分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒的不少于 5 分钟。消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期序消毒对象消毒方法有效期名称号175%乙醇用于设备表面、器具和手消毒。采用擦拭或喷密闭保存 D级： 30 天洒

3、方式0.1%新洁尔灭溶用于地面、墙面、器具、工作服、采用擦拭或浸密闭保存 D级： 30 天2清洁布、拖布和洁净鞋的消毒泡方式液0.2%的新洁尔灭用于水池和地漏的消毒用于液封密闭保存 D级： 30 天3溶液0.5%醋酸氯己定用于水池和地漏的消毒用于液封密闭保存 D级： 30 天4溶液0.1%醋酸氯己定用于工作服、清洁布、拖布和洁密闭保存 D级： 30 天5净鞋的消毒采用浸泡方式溶液2.2.为了确认消毒剂的消毒效力， 通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。其中，.用定量悬浮试验法和表面实验法进行实验室考察试验部分。洁净区设施表面材质基本都是不锈钢和玻璃两种，故表面试验法选用不锈钢载片和玻璃

4、裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验。两种试验方法作用的消毒剂见表。序号试验方法消毒剂1表面实验法75%乙醇234定量悬浮试验法0.1%新洁尔灭溶液0.3%的新洁尔灭溶液0.1%新洁尔灭溶液50.5%醋酸氯己定溶液60.1%醋酸氯己定溶液现场考察试验部分选择车间 (D 级) 的配液间、灌装间设备表面消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。3.确认前准备3.1.验证用试剂与材料3.1.1. 菌种序号名称序列号1金黄色葡萄球菌CMCC(B)260032大肠埃希菌CMCC(B)441023枯草杆菌芽孢CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F) 980013.1.2. 培养基序号名称备注1营

5、养琼脂培养基2营养肉汤培养基121， 20min 灭菌备用3培养基经胰酪大豆胨琼脂培养基4胰酪大豆胨培养基大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟规格：55mm，取样面积为2525m（编号： BZW12085）.玫瑰红钠琼脂培养接触碟6（编号： BZW15129）3.1.3. 消毒液拟定选用的中和剂序号消毒剂名称中和剂备注175%乙醇中和剂经20.1%新洁尔灭溶液1%卵磷脂 +0.1% 聚山梨酯 80121，20min 灭30.2%的新洁尔灭溶液菌备用。3.1.4. 稀释液0.9%无菌氯化钠溶液（ NS）3.1.5. 器具及设备序号名称1无菌移液管2锥形瓶3无菌试管4恒温水浴锅5恒温恒湿培养箱6恒温恒湿培养

6、箱3.2. 验证用试剂与材料记录见附录 1。4.消毒剂消毒效力试验4.1.中和剂鉴定试验4.1.1. 试验目的通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌剂及其恢复期培养示范有害或不良影响。4.1.2. 菌液的制备及计数4.1.2.1金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌工作菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，3035培养 18 24 小时。取上述培养物用0.9 无菌氯化钠溶液做10 倍系列稀释成11085108 CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为11085108CFU/ml，可不再用 0.9 无菌氯

7、化钠溶液稀释）。.计数时，将 11085108CFU/ml 的工作菌液 10 倍系列稀释成含50100CFU/ml 菌液，并同时采用营养琼脂培养基3035培养 2 天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。4.1.2.2白色念珠菌工作菌液的制备接种白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，23 28培养 24 48 小时。取上述培养物用 0.9 无菌氯化钠溶液做10 倍系列稀释成 11085108CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为 11085108CFU/ml，可不再用 0.9 无菌氯化钠溶液稀释）。计数时，将 11085108CFU/ml 的工作菌液

8、 10 倍系列稀释成含 50 100CFU/ml 菌液， 并同时采用改良马丁琼脂培养基 2328培养 3 天计数 。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。4.1.3. 鉴定试验操作4.1.3.1配制 75%乙醇、 0.1%新洁尔灭溶液、 0.2%新洁尔灭溶液、 40mg/L 的二氧化氯、 60mg/L的二氧化氯，具体操作执行清洁剂和消毒剂管理。将配置好的消毒剂置20 1恒温水浴锅中备用。4.1.3.2分组操作试验分组及稀释操作方法简表混合液 A混合液 B组号取 0.5ml 工作菌液取混合液 A 0.5ml加入下列溶液中加入下列溶液1消毒剂 4.5ml稀释液 4.5ml

9、2消毒剂 4.5ml混匀作用中和剂 4.5ml混匀作用3中和剂 4.5ml10min稀释液 4.5ml10min中和产物 4.5ml（消4毒液与中和剂比例稀释液 4.5ml为 1:1）5稀释液 4.5ml稀释液 4.5ml6稀释液和中和剂各1.0ml 注入无菌平皿中，各制备2 皿。取混合液 B 或混合液B的稀释级溶液 0.5ml 平板计数（ 2 皿 / 组）混合液 B、 10-1混合液 B、 10-110-2、 10-310-2、 0-310-2、 10-3具体操作第 1 组目的：观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。操作：取消毒剂 4.5ml+ 工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min

10、后，取混合液 0.5ml+ 稀释液 4.5ml ，.混匀作用 10min，取 0.5ml 注皿，平行制备 2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置 30 35培养 3 天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置 2328培养 5 天计数计数。第 2 组目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。操作：取消毒剂 4.5ml+ 工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min 后，取混合液 0.5ml +中和剂 4.5ml ，混匀作用 10min，用稀释液稀释成 10-1 。分别取未稀释溶液（混合液 0.5mll+ 中和剂 4.5ml的混合液）及

11、 10-1 0.5ml 注皿，各平行制备 2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于 30 35培养 3 天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于 23 28培养 5 天计数。第 3 组目的：观察中和剂是否有抑菌性操作：取中和剂 4.5ml+ 工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min，取混合液 0.5ml l+ 稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min 后，用稀释液进行 10 倍系列稀释成 10-2 、 10-3 。取相应稀释级 0.5ml 注皿，各稀释级平行制备 2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置 3035培养

12、 3 天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基， 倒置 3035培养 3 天计数计数。第 4 组目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。操作：取消毒剂和中和剂 1:1 的混合液 4.5ml+ 工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min，取混合液0.5ml l+ 稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min 后，用稀释液进行10 倍系列稀释成 10-2 、10-3 。取相应稀释级 0.5ml 注皿，各稀释级平行制备2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30 35培养 3 天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置3035培养 3

13、 天计。第 5 组目的：作菌落数对照用操作：.取稀释液 4.5ml+ 工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min，取混合液 0.5ml l+ 稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min 后，用稀释液进行 10 倍系列稀释成 10-2 、 10-3 。取相应稀释级 0.5ml 注皿，各稀释级平行制备2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置 3035培养 3 天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置 3035培养 3 天计数。第 6 组目的：作为阴性对照用操作：分别取稀释液和中和剂各 1.0ml 注入无菌平皿中，各制备 2 皿。4.1.3.3结果判断试验结果应

14、符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。第 1 组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。第 2 组菌落数比第 1 组菌落数多，但比第 3、4、5 组菌落数少，且符合下表要求第 1 组平板平均菌落数第 2 组平板平均菌落数05x (x+5)y (y+0.5y)第 3、 4、 5 组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过 15%。计算公式如下：（3 组间菌落平均数 - 各组菌落平均数）的绝对值之和误差率10033组间菌落平均数第 6 组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。4.1.4. 中和剂鉴定试验记录见附录2。4.2.定量悬浮试验4.2.1. 试验目的由于 0.2%的新洁尔灭溶液、

15、 0.1%新洁尔灭溶液、 60mg/L 二氧化氯溶液、 0.5%醋酸氯己定溶液、 0.1%醋酸氯 己定溶液是通过浸泡或液封消毒，通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。4.2.2. 试验操作4.2.2.1配制 0.2%的新洁尔灭溶液、 0.1%新洁尔灭溶液、 60mg/L 二氧化氯溶液、 0.5%醋酸氯己.定溶液、 0.1%醋酸氯 己定溶液，操作执行清洁剂和消毒剂管理。将配置好的消毒剂置 20 1恒温水浴锅中备用。4.2.2.2由于 0.2%的新洁尔灭溶液、 0.1%新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶

16、液、 0.1%醋酸氯 己定溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。4.2.2.3将菌液制备成 1108 5108CFU/ml 的工作菌液，菌液的制备及计数同8.1.2 。4.2.2.4将试管按需要分组排列在试管架上，试验组分3 组（ 4min、5min、 6min 各一组），并由左向右逐管标明消毒剂、中和剂、10-1 、10-2 。对照组分 1 组，并由左向右逐管标明稀释液、中和剂、 10-1 、10-2 、 10-3 、10-4 。 。4.2.2.5向个试管加入 4.5ml 相应的试剂，标明10-1 、 10-2 、10-3 、

17、10-4 。 加入 4.5ml 的稀释液。4.2.2.6吸取工作菌液 0.5ml 加入标明消毒剂的试管中， 对照组加入标明稀释液的试管中，迅速混匀，并开始计时。4.2.2.7待菌液与消毒剂相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒剂混合液0.5ml ，加入标明中和剂的试管中，迅速混匀。4.2.2.8中和作用 10min 后，吸取 0.5ml 加入标明 10-1的试管中，混匀后吸取0.5ml 加入标明10-2 试管中（对照组以此类推，对照组直至10-4 ）。4.2.2.9试验组分别取中和剂管、 10-1 、 10-2 管溶液 1ml 按平皿法测定存活菌数；对照组取10-3 、10

18、-4 1ml 按平皿法测定存活菌数。每管平行制备2 皿。4.2.2.1金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于3035培养 3 天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于23 28培养 5 天计数。4.2.3. 结果计算计算试验组和对照组的活菌浓度 （ CFU/ml），并换算为对数值（ N），并按下式计算杀灭对数值 :杀灭对数值(KL) 对照组平均活菌浓度的对数值 （NO）试验组活菌浓度对数值 （NX）4.2.4. 可接受标准杀灭对数值(KL) 应不低于 35 个对数单位。4.2.5. 定量悬浮试验记录见附录34.3.表面试验法4.3.1. 试验目的.由于 75%

19、乙醇、40mg/L 二氧化氯溶液、 0.1%新洁尔灭溶液是通过擦拭消毒，故选用不锈钢载片和玻璃裁片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。4.3.2. 菌种选择由于 75%乙醇、 0.1%新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。0.5%醋酸氯己定溶液、 0.1%醋酸氯 己定溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。4.3.3. 工作菌液制备工作菌液的制备方法、浓度及验证同步计数操作同8.1.2 。4.3.4. 试验操作4.3.4.1（1） 染菌不锈钢载片制备将经灭菌的

20、载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌含菌量为 11085108CFU的菌液 0.1ml ，并均匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。（2）染菌玻璃载片制备因培养皿的材质为玻璃， 故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。 进行菌液滴染前， 用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（ 50mm50mm），标注清晰。菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。4.3.4.2试验组：将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为8min、10min、12min，不锈钢载片和玻璃载片每个作用时间分别制备2 个。作用

21、结束后，用接触碟取样 （接触2碟规格：55mm，取样面积为 25m）。取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟（编号：BZW12085）；取样白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基接触碟（编号：BZW15129）。接触碟取样方法： 打开接触碟盖， 使无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触10 秒左右，在盖上跌盖。对照组对照组的活菌浓度计数见8.3.3 。.阴性对照：用接触碟在已灭菌的载片上（未染菌片的载）按压取样，操作同上。每种载片及每种接.触碟平行制备两份。4.3.4.3培养将取样金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌、 枯草杆

22、菌芽孢菌的接触碟倒置于30 35培养 3天计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于2328培养 5 天计数计数。4.3.4.4结果计算计算试验组和对照组的活菌浓度 （ CFU/ml），并换算为对数值（ N），并按下式计算杀灭对数值 :杀灭对数值(KL) 对照组平均活菌浓度的对数值 （NO）试验组活菌浓度对数值 （NX）4.3.4.5可接受标准杀灭对数值 (KL) 应不低于 35 个对数单位。4.3.5. 表面试验法记录见附录 54.4.现场考察试验4.4.1. 消毒前对洁净区进行表面微生物取样。取样地点： D级车间的配料间墙壁和设备表面、灌装间墙壁和设备表面、中间站墙壁表面。取样操作及检验执行表面微生物检验。4.4.2. 生产操作结束后操作人员按照生产区清洁对洁净区进行清洁消毒。4.4.3. 清洁消毒完毕 15 分钟后，现场 QA对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物取样。取样地点：固体车间（ D级）的制粒间一墙壁和设备表面、小容量注射剂车间(C 级)的配液间墙壁和设备表面、灌封间层流罩（ A 级）下设备表面。取样操作及检验执行表面微生物检验。4.4.4. 至少进行 3 次试验。4.4.5. 可接受标准2消毒后： D级： 50CFU/25cm4.4.6. 现场考察试验记录见附录 55.消毒剂有效期确认试验5.1.试验目的通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不