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文档简介
1、尿香草扁桃酸(v M A)测定分光光度法参考值:年龄010天10天24个月24 个月 18 岁成人(一)原理用乙酸乙酯从酸化尿液中提取 VMA和其他酚酸,然后反提取到碳酸钾水 层。加入高碘酸钠(Na 104),使V M A氧化成香草醛(van ill i n)。用甲苯从 含有酚酸杂质的溶液中选择性提取香草醛,再用碳酸盐溶液反抽提到水层,用 分光光度计于波长 360nm 测定水层中香草醛的浓度。(二)病人准备与标本处理1 收集标本前 1 周限制病人食用含有香草醛类的食物,如巧克力、咖啡、 柠檬、香蕉以及阿司匹林和一些降压药物,这些药物中含有酚酸对该法有阳性 干扰,可使结果假性升高。2尿量应通过饮
2、水调控在 10003000ml24h 之间。3收集 24 小时尿液加浓盐酸约 10ml 或甲苯 5ml 防腐。若尿液不能及时进 行测定,应置冰箱28C保存,以免VMA被破坏而使测定数值减低。(三)试剂1. 6 mol/LH C。2. NaCl (固体)。3. 乙酸乙酯41mo lL 碳酸钾:称取138g无水碳酸钾溶于蒸馏水中并补足至 1L。室温保存,超过一个月须 重配。5 20gL 偏高碘酸钠:称取 2g 偏高碘酸钠( NaIO4MW213.89),溶于蒸馏水中并补足至 100 ml。须当天新配。6. 100g/ L偏重亚硫酸钠:称取10g偏重亚硫酸钠(M W190.10)溶于蒸馏水中并补足至
3、100 ml,须当天新配。7. 5mo lL 乙酸:取 286ml 冰乙酸加蒸馏水至 1L。8. 1mo 1/ L磷酸盐缓冲液,PH7.5A 液:取286g磷酸二氢钠(Na2HPO47H2O),加蒸馏水至1L,置冰箱保存。B液:取27.22g磷酸二氢钾(KH2PO4,加蒸馏水至200ml,置冰箱保 存。取 A 液168.2ml 与 B 液31.8mlmg/24hv0. 1v2. 0v5. 027 mo l/24hv0. 5v 10v 251035混合,用酸度计核对或调节至 pH7.5,置冰箱保存。9. 0.01mo 1/LHC。10 .标准液(1) V M A标准贮存液(1 mg/ml,5.0
4、5m mo l/L):精确称取 100mg VMA(M W198.17)置于 100ml 容量瓶中,加0.01mo 1/LH Cl至刻度,混匀。置冰箱保存,约可稳定 3个月。(2) V M A (10卩/ml,50.5 go I/L):取 10ml 标准贮存液,加0.01mo I/LHCI至 100 ml,用前新鲜配制。(四) 操作1. 取 3 支具塞 50ml 试管,标记 “测定管”、“内标准管 ”和“未氧化空白管 分别加入 1 份尿液(相当于 24 小时尿总量的0.2体积)。2. 向内标准管”中加入V M A标准应用液1.0 ml。3. 用蒸馏水将各管体积补足至5.5 ml 再加入 6mo
5、 l/LHCl0.5 ml,使尿液进一步酸化。4. 向各管加入固体氯化钠(约 3g),充分混匀使过饱和,再加入乙酸乙酯 30ml,用力振摇 30 min,离心(?1500rpm)5 min,提取 V M A。5. 取第二批具塞试管 3 支,同样标记 “测定管 ”、“内标准管 ”和“未氧化空白 管”,各加 1mo lL 碳酸钾溶液1.5 ml。然后,分别依次加入相应的乙酸乙酯提取液(上层)25 ml,用力振摇3 min,离心(?1500rpm)5min,吸弃上层乙酸乙酯层。6. 取第三批具塞大试管 3 支,同样标记 “测定管 ”、“内标准管 ”和“未氧化空 白管”,分别依次加入相应的碳酸钾提取液
6、(下层)1.0ml。7. 向 “测定管 ”、“内标准管 ”加入 20gL 高碘酸钠0.1ml,混匀,未氧化空白管”不加高碘酸钠。所有试管均置50C水浴30min。然后,取出各管冷却至室温。向未氧化空白管 ”补加 20gL 高碘酸钠0.1 ml,混匀。8. 立即向各管加入 100gL 偏重亚硫酸钠0.1ml,还原反应液中残留的高碘酸钠。9. 向各管加入 5mo lL 乙酸0.3ml,以中和反应液,混匀后放置10min。10 .向各管加1mo 1/ L磷酸盐缓冲液(pH7.5)0.6ml (可加入0.4g/L甲酚红1滴检查pH。此时,溶液必须呈黄色,表示 pHv8.8)。11 .向各管加入甲苯20
7、ml,用力振摇3mi n,离心(?1500rpm)5mi n,提取V M A 的氧化产物香草醛。12. 取第四批具塞大试管 3支,标记“测定管”、“内标准管”和“未氧化空白 管”各加1mo 1/L碳酸钾4 ml,然后分别依次加入相应的甲苯提取液(上层? 下层?)15 ml,用力振摇 3min,离心(?1500rpm)5min。13. 分别将下层碳酸钾提取液(含香草醛)吸到比色杯中,于波长360nm 处用蒸馏水调零,读取各管吸光度(A测定、A内标和A空白)。(五)计算尿液 V M A ( mo/d)=尿液 V M A (mg/d) x5.046式中A内标为内标准管吸光度(标准+测定)10为内标准
8、管”中含10V M A1000为由 血转换成mg0.2为取24h总尿量的0.2体积(六)试验说明1 .本法所以要用“内标准”是为了补偿由于操作过程中的丢失、香草醛分解 和尿中可能存在的某些抑制物的影响,使结果更为可靠。2. 在室温下,纯的VMA溶液较易被高碘酸盐氧化,但在尿的提取液中要 将温度提高到50C,才能氧化。有时即使在50C,氧化作用也会被强烈抑制,所以本法要在50C作用30min。pH值对氧化过程影响也很大,在中性和酸性条 件下,氧化产生黄色色素。而在强碱性时,反应延迟并可使香草醛分解。3. 香草醛的最大光吸收是在 348nm,但在该波长下,尿中的正常成分对羟 扁桃酸的氧化产物对羟苯甲醛也有明显的光吸收,因此选用 360nm。在此波长 下,香草醛的光吸收仅是峰值的 80%,但干扰最小。在350nm和380nm香草 醛吸光度显著下降
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