尿香草扁桃酸(VMA)测定

1、尿香草扁桃酸（v M A）测定分光光度法参考值：年龄010天10天24个月24 个月 18 岁成人（一）原理用乙酸乙酯从酸化尿液中提取 VMA和其他酚酸，然后反提取到碳酸钾水 层。加入高碘酸钠（Na 104）,使V M A氧化成香草醛（van ill i n）。用甲苯从 含有酚酸杂质的溶液中选择性提取香草醛，再用碳酸盐溶液反抽提到水层，用 分光光度计于波长 360nm 测定水层中香草醛的浓度。（二）病人准备与标本处理1 收集标本前 1 周限制病人食用含有香草醛类的食物,如巧克力、咖啡、 柠檬、香蕉以及阿司匹林和一些降压药物,这些药物中含有酚酸对该法有阳性 干扰,可使结果假性升高。2尿量应通过饮

2、水调控在 10003000ml24h 之间。3收集 24 小时尿液加浓盐酸约 10ml 或甲苯 5ml 防腐。若尿液不能及时进 行测定，应置冰箱28C保存，以免VMA被破坏而使测定数值减低。（三）试剂1. 6 mol/LH C。2. NaCl （固体）。3. 乙酸乙酯41mo lL 碳酸钾：称取138g无水碳酸钾溶于蒸馏水中并补足至 1L。室温保存，超过一个月须 重配。5 20gL 偏高碘酸钠：称取 2g 偏高碘酸钠( NaIO4MW213.89)，溶于蒸馏水中并补足至 100 ml。须当天新配。6. 100g/ L偏重亚硫酸钠：称取10g偏重亚硫酸钠(M W190.10)溶于蒸馏水中并补足至

3、100 ml,须当天新配。7. 5mo lL 乙酸：取 286ml 冰乙酸加蒸馏水至 1L。8. 1mo 1/ L磷酸盐缓冲液，PH7.5A 液：取286g磷酸二氢钠(Na2HPO47H2O),加蒸馏水至1L,置冰箱保存。B液：取27.22g磷酸二氢钾(KH2PO4，加蒸馏水至200ml，置冰箱保 存。取 A 液168.2ml 与 B 液31.8mlmg/24hv0. 1v2. 0v5. 027 mo l/24hv0. 5v 10v 251035混合，用酸度计核对或调节至 pH7.5，置冰箱保存。9. 0.01mo 1/LHC。10 .标准液(1) V M A标准贮存液(1 mg/ml,5.0

4、5m mo l/L)：精确称取 100mg VMA(M W198.17)置于 100ml 容量瓶中，加0.01mo 1/LH Cl至刻度，混匀。置冰箱保存，约可稳定 3个月。(2) V M A (10卩/ml,50.5 go I/L):取 10ml 标准贮存液，加0.01mo I/LHCI至 100 ml,用前新鲜配制。(四) 操作1. 取 3 支具塞 50ml 试管，标记 “测定管”、“内标准管 ”和“未氧化空白管 分别加入 1 份尿液(相当于 24 小时尿总量的0.2体积)。2. 向内标准管”中加入V M A标准应用液1.0 ml。3. 用蒸馏水将各管体积补足至5.5 ml 再加入 6mo

5、 l/LHCl0.5 ml,使尿液进一步酸化。4. 向各管加入固体氯化钠（约 3g）,充分混匀使过饱和，再加入乙酸乙酯 30ml，用力振摇 30 min,离心（？1500rpm）5 min,提取 V M A。5. 取第二批具塞试管 3 支，同样标记 “测定管 ”、“内标准管 ”和“未氧化空白 管”,各加 1mo lL 碳酸钾溶液1.5 ml。然后，分别依次加入相应的乙酸乙酯提取液（上层）25 ml，用力振摇3 min，离心（?1500rpm）5min，吸弃上层乙酸乙酯层。6. 取第三批具塞大试管 3 支,同样标记 “测定管 ”、“内标准管 ”和“未氧化空 白管”，分别依次加入相应的碳酸钾提取液

6、（下层）1.0ml。7. 向 “测定管 ”、“内标准管 ”加入 20gL 高碘酸钠0.1ml，混匀，未氧化空白管”不加高碘酸钠。所有试管均置50C水浴30min。然后，取出各管冷却至室温。向未氧化空白管 ”补加 20gL 高碘酸钠0.1 ml，混匀。8. 立即向各管加入 100gL 偏重亚硫酸钠0.1ml，还原反应液中残留的高碘酸钠。9. 向各管加入 5mo lL 乙酸0.3ml，以中和反应液，混匀后放置10min。10 .向各管加1mo 1/ L磷酸盐缓冲液（pH7.5）0.6ml （可加入0.4g/L甲酚红1滴检查pH。此时，溶液必须呈黄色，表示 pHv8.8）。11 .向各管加入甲苯20

7、ml，用力振摇3mi n,离心（？1500rpm）5mi n,提取V M A 的氧化产物香草醛。12. 取第四批具塞大试管 3支,标记“测定管”、“内标准管”和“未氧化空白 管”各加1mo 1/L碳酸钾4 ml,然后分别依次加入相应的甲苯提取液（上层？ 下层？）15 ml,用力振摇 3min,离心（?1500rpm）5min。13. 分别将下层碳酸钾提取液（含香草醛）吸到比色杯中，于波长360nm 处用蒸馏水调零，读取各管吸光度（A测定、A内标和A空白）。（五）计算尿液 V M A （ mo/d）=尿液 V M A （mg/d） x5.046式中A内标为内标准管吸光度（标准+测定）10为内标准

8、管”中含10V M A1000为由 血转换成mg0.2为取24h总尿量的0.2体积（六）试验说明1 .本法所以要用“内标准”是为了补偿由于操作过程中的丢失、香草醛分解 和尿中可能存在的某些抑制物的影响,使结果更为可靠。2. 在室温下，纯的VMA溶液较易被高碘酸盐氧化，但在尿的提取液中要 将温度提高到50C，才能氧化。有时即使在50C,氧化作用也会被强烈抑制，所以本法要在50C作用30min。pH值对氧化过程影响也很大，在中性和酸性条 件下，氧化产生黄色色素。而在强碱性时，反应延迟并可使香草醛分解。3. 香草醛的最大光吸收是在 348nm,但在该波长下，尿中的正常成分对羟 扁桃酸的氧化产物对羟苯甲醛也有明显的光吸收，因此选用 360nm。在此波长 下，香草醛的光吸收仅是峰值的 80%，但干扰最小。在350nm和380nm香草 醛吸光度显著下降