2021年羊松果体细胞原代培养及其生物学特性的研究

1、羊松果体细胞原代培养及其生物学特性的研究 松果体为哺乳动物的重要神经内分泌器官，产生多种胺类和肽类物质，下面是搜集的一篇探究羊松果体细胞原代生物特性的，欢迎阅读查看。 ：体外培养山羊及绵羊的松果体细胞，观察其增殖情况和功能状态的变化。结果显示：山羊、绵羊的松果体细胞体外形态及生长情况相似。细胞多呈圆形或多角形，细胞体积有增大趋势。采用MTT了法检测细胞生长状态，发现细胞有明显的增殖现象，大约于11d达到高峰，用免疫 _化学对培养细胞进行染色，发现5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。表明山羊和绵羊松果体细胞在体外均增殖旺盛，并能保持体内的分泌功能。 松果体为哺乳动物的重要神经内分泌器官，产生

2、多种胺类和肽类物质，其主要分泌物-褪黑素(MT)对许多器官的功能具有重要的调节作用。为了解松果体的生理价值，许多学者采用体外培养技术研究其细胞形态和分泌功能.体外构建松果体 _并植入动物体内成为目前研究的热点，这些研究有助于深入了解松果体的活动特点，为进一步调节动物体内松果体细胞分泌的研究积累材料。 哺乳动物松果体细胞培养早在20世纪70年代国外就有报道，1977年Rowe首次观察了体外培养大鼠松果体细胞的形态，1978年Budat成功检测了培养的大鼠松果体细胞褪黑素合成和分泌功能。本实验以山羊和绵羊作为研究对象，对其松果体进行体外培养，观察在无其他因素干扰条件下山羊和绵羊松果体细胞的形态变化

3、、增殖过程和功能状态的异同，为研究松果体细胞分泌特点及改变动物繁殖现状提供依据。 1.1主要实验试剂及仪器 DMEM培养液(GIBCO，美国)，M199培养液(sig _，美国)，犊牛血清(sig _，美国)，胰蛋白酶(sig _，美国)，双抗(武汉亚法)，MTr(sig _，美国)，DMSO(国产分析纯)，兔抗5-HT血清(武汉 _德)，SABC试剂盒(武汉 _德)，DAB显色试剂盒(武汉 _德)，自动酶标仪(Tecan，澳大利亚)，C02培养箱(LABLINE，美国)，倒置显微镜(Nikon， _)。 1.2松果体细胞的体外培养 按 _方法屠宰1岁龄健康莱芜黑山羊6只、小尾寒羊5只，分别进

4、行以下步骤：迅速开颅取出松果体，冷D-hank昌液冲洗;剪碎后，0.25%胶原酶消化30min，含血清培养液中和，反复吹打，离心;加完全培养液吹打混匀，按每mL1xl04的细胞密度分别接种于96孔培养板(分7组，每组6孔)和24孔板(分7组，每组3孔，每孔内置一盖玻片)，放人37、5%C02培养箱内培养。另外，本 实验中山羊采用DMEM培养液，绵羊采用M199培养液。 1.3MTT法检测细胞增殖 从培养第3d开始，隔日取96孔板内一组细胞，每孔加入MTY15L，继续培养4h后，每孔加入DMSO30gL，吹打至沉淀完全溶解后，在0D570。处测吸光度值并绘制曲线。 1.45-HT免疫 _化学方法

5、24孔板每组从第3d开始隔日取出细胞爬片，PBS冲洗，冷95%乙醇固定10min;用正常羊血清在室温下封闭30rain;加入兔抗5HT血清(1：100)37孵育2h，然后4过夜，PBS冲洗3rainx3;加入生物素标记的IgG，3730min，PBS冲洗3minx3;SABC复合物37下作用30rain，PBS洗3minx3;DAB镜下显色510Min;苏木素复染，脱水，透明，封片观察。 2.1松果体细胞的形态观察 2.2MTT检测结果 从表1和图3可以看出，体外培养的松果体细胞数量前7d增长缓慢，第9d开始 _增殖速度加快，于第11d左右达到高峰，此后生长曲线开始缓慢下降。 2.3.5-HT

6、免疫组化染色结果 不同培养时期都可见细胞爬片上布满棕黄色的5-HT阳性细胞，培养后期细胞的阳性反应仍然明显，松果体细胞多呈圆形或多角形，高倍镜下细胞中阳性物质呈不均质分布，细胞轮廓无明显界限，复染后核位于细胞中间，呈规则的圆形(图4、5)。培养前期随时间延长，阳性细胞数有增加现象;在11d细胞增殖达高峰后，阳性细胞数量变化不大。 1)体外条件下培养山羊、绵羊的松果体细胞形态相似，初期呈小圆形、折光性强，后期细胞逐渐增大、折光性减弱，这与廖华对大鼠松果体细胞的报道基本一致。 2)MTT比色法是一种检测细胞增殖情况的经典方法，酶标仪所测的OD值可反映出细胞的相对数量。从测量OD值得出的生长曲线可见

7、，两种羊虽在不同培养液中生长，但其增殖趋势相同，松果体细胞在培养第9d开始增殖，11d左右达到高峰，随后增长缓慢。证明松果体细胞在常规培养条件下，能保持其增殖能力，细胞数目明显增加，而在成年动物体内，松果体细胞与神经元一样，数目恒定且很难再生。对于一特定动物来说，随着年龄的增长松果体细胞开始退化，同时也没有新生的细胞出现，因此松果体这一器官将逐渐衰老而无法发挥其功能。本实验发现体外松果体细胞表现出明显的增殖现象，说明体外构建松果体 _用于解决细胞的更新问题渴望成为可能。 3)褪黑素是松果体细胞的主要分泌物，而它是由色氨酸在多种酶的作用下转化而成，因此检测转化过程中的任一中间产物或酶都可反映细胞

8、的功能状态，本实验采用目前常用的5羟色胺免疫细胞化学染色，因为5-羟色胺作为MT的前体与MT的分泌有着密切的关系，可初步判断松果体细胞的功能状态。我们对培养不同时期的细胞爬片进行抗5羟色胺免疫细胞化学染色，发现爬片上布满阳性细胞，细胞中含有大量呈点状的阳性颗粒，细胞多为圆形和不规则形，阳性细胞数量随细胞总数的增加而增加。证明体外增殖的松果体细胞具有合成5-HT，分泌MT的能力。 4)本研究所选的实验动物山羊、绵羊均为季节性繁殖动物，光周期是影响其生殖活动的主要环境因素。松果体分泌的褪黑素在光周期 _过程中处于调控的中心地位，褪黑素主要通过与下丘脑-垂体性腺轴的相互作用达到动物生殖周期与环境光周期的同步变化。实验证明体外构建的松果体 _具有旺盛的增殖和分泌能力，因此