高等结构分析：激光共聚焦显微术及其在纳米生物科学中的应用

1、激光共聚焦显微术及其在纳米生物科学中的应用,Outline,一、显微镜发明历史回顾 光学显微镜成像历史、常用概念 二、激光共聚焦显微术原理： （传统光学成像原理VS 共聚焦成像原理 光切、三维成像、荧光强度、光谱分析） 三、激光共聚焦显微术在纳米生物学研究中的应用 热点之一：量子点（CdSe、CdTe） 热点之二：硅壳纳米荧光颗粒 热点之三：ZnO纳米颗粒 四、双光子激光共聚焦显微镜,分辨率极限,在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善，例如人们发明了能够消除色差（当不同波长的光线通过透镜的时候，它们折射的方向略有不同，这导致了成像质量的下降）和其他光学误差的透镜组。 与19世纪的显

2、微镜相比，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因很简单：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。 如果仅仅在纸上画图，你自然能够“制造”出任意放大倍数的显微镜。但是光的波动性将毁掉你完美的发明。即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，你就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事了。 对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。 提高显微镜分辨率的途径之一就是

3、设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。,Khler Illumination,一、什么是柯勒照明？ 1893年德国蔡司的科勒先生(August Kohler) 首先研发了一种完善的照明方法, 而成为一种能对样品提供最佳照明的方。随后，由于这一方法能使样品获得均匀而又充份明亮的照明，而且又不会产生耀眼的眩光。 因此，近代的实验室用显微镜制造厂都纷纷推荐使用这一方法， 从而使得显微镜的使用人员可以发掘出显微镜的所有潜在能力。,二、科勒照明的好处？ 1

4、. 灯丝不落在被检物平面上，照明均匀； 2. 照明的热焦点不在被检物，不会灼伤被检物； 3. 聚光镜将视场光阑成像在被检物平面处，改变大小可控制照明范围。,Khler Illumination,Specimen,Field stop,Field iris,Conjugate planes for illuminating rays,Specimen,Field stop,Field iris,Conjugate planes for image-forming rays,condenser,eyepiece,retina,Properties of Light,Refraction A Len

5、s Refractive Index Numerical Aperture Resolution Aberrations Fluorescence,Ocular Objectives Condenser Numerical Aperture Refractive Index Aberrations Optical Filters,Microscope Components,Reflection and Refraction（反射和折射）,Snells Law: The angle of reflection (r) is equal to the angle of incidence (i)

6、regardless of the surface material The angle of the transmitted beam (t) is dependent upon the composition of the material,t,i,r,Incident Beam,Reflected Beam,Transmitted (refracted)Beam,Properties of thin Lenses,f,1,p,+,1,q,=,1,f,f,p,q,Magnification =,q,p,(lateral),(Rayleigh criterion),Numerical Ape

7、rture,Resolving power is directly related to numerical aperture. The higher the NA the greater the resolution Resolving power: The ability of an objective to resolve two distinct lines very close together NA = n sin u (n=the lowest refractive index between the object and first objective element) (ho

8、pefully 1) u is 1/2 the angular aperture of the objective,A,m,NA=n(sin m),Light cone,(n=refractive index),Numerical Aperture,For a narrow light beam (i.e. closed illumination aperture diaphragm) the finest resolution is (at the brightest point of the visible spectrum i.e. 530 nm)(closed condenser).,

9、NA,2 x NA,.00053,2 x 1.00,= 0.265 m,With a cone of light filling the entire aperture the theoretical resolution is(fully open condenser).,=,=,Object Resolution,Example: 40 x 1.3 N.A. objective at 530 nm light,2 x NA,.00053,2 x 1.3,= 0.20 m,=,40 x 0.65 N.A. objective at 530 nm light,2 x NA,.00053,2 x

10、 .65,= 0.405 m,=,R=l/(2NA)1 R=0.61 l/NA2 R=1.22 l/(NA(obj) + NA(cond)3,Numerical Aperture,For a narrow light beam (i.e. closed illumination aperture diaphragm) the finest resolution is (at the brightest point of the visible spectrum i.e. 530 nm)(closed condenser).,NA,2 x NA,.00053,2 x 1.00,= 0.265 m

11、,With a cone of light filling the entire aperture the theoretical resolution is(fully open condenser).,=,=,Object Resolution,Example: 40 x 1.3 N.A. objective at 530 nm light,2 x NA,.00053,2 x 1.3,= 0.20 m,=,40 x 0.65 N.A. objective at 530 nm light,2 x NA,.00053,2 x .65,= 0.405 m,=,R=l/(2NA)1 R=0.61

12、l/NA2 R=1.22 l/(NA(obj) + NA(cond)3,Fluorescence Microscopes,Cannot view fluorescence emission in a single optical plane Generally use light sources of much lower flux than confocal systems Are cheaper than confocal systems Give high quality photographic images (actual photographs) whereas confocal

13、systems are restricted to small resolution images,Fluorescent Microscope,Objective,Arc Lamp,Emission Filter,Excitation Diaphragm,Ocular,Excitation Filter,Objective,Laser,Emission Pinhole,Excitation Pinhole,PMT,Emission Filter,Excitation Filter,Confocal Microscope,Resolution Widefield vs Confocal,Con

14、ventional,Confocal,Res = 0.61*l / NA,Res(xy) = 0.4*l / NA,Res(xz) = 0.45*l / n(1-cosa),Formulas by Kino,激光扫描共聚焦显微镜（特点）,- 以激光作为光源 - 扫描时激光点在样品上移动 - 焦平面以外的光被针孔（Pinhole）阻断 - 针孔大小可调 - 用光电倍增管 (PMT) 采集光信号,1. 多荧光标记样品的图像采集 2. 无损伤、连续光学切片，显微“CT” 3. 真正的三维重组 4. 可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切 5. 定量分析 6. xyt 、xzt 和 xt

15、扫描 时间序列扫描 7. 图像处理 8. 旋转扫描 9. 区域扫描 10. 光谱扫描,Confocal功 能,共聚焦应用,定位、定量 三维重组 (XYZ) 动态测量 (XYT) 游离Ca2+浓度的测量 H+浓度 (pH值)的测量 自由基的检测 药物进入细胞的动态 过程定位分布及定量 细胞膜电位的测量,基本应用,高级应用,4F FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching ) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FLIM (Fluorescence lifetime imaging mic

16、roscopy) FCS (Fluorescence correlation spectroscopy),自发荧光 荧光染色（特异性荧光探针） 免疫荧光荧光抗体 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光(如： 量子点、纳米荧光材料) 诱发荧光（Induced fluorescence） 酶致荧光（Enzymatically produced fluorescence）,组织和细胞样品中荧光的来源：,1990 年,美国康奈尔大学Denk 等人提出将双光子激发现象应用到共焦激光扫描荧光显微镜中,从而为共焦激光扫描显微镜的更广泛应用开辟了道路. 双光子激发共焦激光扫描荧光显微镜较好地克服了单光子激发共焦

17、激光扫描荧光显微镜的缺点,而且有着较高的空间分辨率. 由同时吸收2 个以上的光子组成的多光子激发激光扫描荧光显微镜超过了常规的单光子共焦荧光显微镜的分辨极限. 目前,多光子激发共焦激光扫描荧光显微镜已引起了各国学者的广泛注意和兴趣.,双光子激光共聚焦显微术,双光子激光共聚焦显微术,双光子吸收与单光子吸收,单光子吸收的强度与入射光强成正比（线形吸收），双光子吸收的强度与入射光强的平方成正比（非线形吸收）； 单光子吸收的辐照光源一般在紫外区（400nm），双光子在可见-近红外区（800nm），长波长使得入射光的损耗较小，在介质中的穿透性好； 双光子吸收过程一般是两个光子同时被一个分子吸收，或者在极

18、短的时间内两个光子被一个分子相继吸收，一般两个光子吸收的时间差小于0.1飞秒（1飞秒=10-15秒）。一般认为吸收是经过一个假想态（virtual state），然后到达一个分子的激发态。,单光子吸收的吸收截面为 10-1710-18 cm4s/photon，对光密度要求小，即使弱光也可发生吸收，在光线经过的地方都会发生聚合，是整体或面上的聚合; 双光子吸收截面一般为10-5010-46cm4s/photon，一般在两束光聚焦的焦点处才能同时吸收两个光子，引发聚合反应，聚合反应只发生在入射光波长立方（3）范围的微小体积内。 双光子吸收截面： TP=43ao5 2 TP 15c f 即双光子可进

19、行立体微加工。,多光子（MP）的低能量光子浓度决定了一定时间一定空间内同时作用在染料上的概率, 只有在焦点区域才有这概率形成同时作用去激发出荧光.SP的单个光子有足够能量去激发出荧光.,图2 是单、双光子激发所产生的荧光形貌. 从图2 可以看出,由于单光子激发的线性过程,在整个激发光路里的样品都由于激发而发出荧光,而对于双光子激发而言,只有在焦点处的微小区域内样品才能吸收足够的双光子而发出荧光.,同常规的单光子激发共焦激光扫描荧光显微镜相比,双光子共焦激光扫描荧光显微镜光源多采用锁模的飞秒钛宝石激光器以得到足够强的激光,保 证对样品进行双光子激发. 双光子吸收一般采用较大功率的红宝石或蓝宝石脉

20、冲激光器，波长800nm1000nm左右，要求激光器的功率大于一个最低值，一般在30J100J。利用双光路聚焦的方法。 考虑到显微镜内复杂的光学元件对飞秒脉冲的影响,可以在光路中插入腔外脉冲压缩器,对超快激光在物镜焦点处的脉冲展宽和脉冲畸变进行优化和压缩. 另外,由于材料的双光子吸收强烈地与激发光强的平方相关,因而在紧聚焦的条件下,双光子吸收仅局域于物镜焦点处的空间体3 的小范围内,使人们可以或甚至不使用共焦小孔,就能得到高清晰的三维图像,使共焦显微镜的设计大为简化,易于操作. 这是多光子激发的一大优势.,双光子吸收的光源,双光子共焦激光扫描荧光显微镜优点之1 ：低损伤,在生物医学研究中,为了获得足够精度的数据,以进行定量分析,用作标记的荧光剂或试样本身的激发和荧光波长往往在紫外和近紫外波段. 比如NADH 酶的荧光峰为450nm ,且必须用350nm 的激光激发. 然而,这种波长的紫外光对生物组织常常是有害的. 同时,在研究生物体组织