基因工程总结资料

1、基因工程 第一章绪论1、基因工程的含义：按照人们的意愿，进行严密的设计，通过体外 在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。2、基因工程的优点：打破物种间基因交流的隔离界限；克服常规育种的周期长，效率低的缺点，定向改造生物性状；可按照人的 意愿去改造物种。3、基因工程理论依据：不同基因具有相同的物质基础；基因是可分割的；基因是可以转移的；多肽与基因之间存在对应关系； 遗传密码是通用的；基因可以通过复制传递给下一代。注：基因工程及其应用的图解看看DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种第二章DNA重组的相关技术及原理1、重组DNA技术的原理重组DNA技术是指将

2、一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内， 使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序2、碱性SDS法提取质粒DNA原理：强碱使所有DNA变性沉淀，而pH为中性时，质粒 DNA复性快，形成闭合环状从沉淀物中分离。3、提取DNA总的原则 保证核酸一级结构的完整性； 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其他核酸分子，如 RNA也应尽量去除。4、核酸鉴定浓度鉴定纯度鉴定完整性鉴定5、 限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链 二酯键断开的内脱氧核

3、糖核酸酶。6、限制性内切酶的命名 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成大肠杆菌（Escherichia coli ） Eco流感嗜血菌（Haemo philus in flue nzae ） Hin 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp）,并使每条链的一个磷酸3个字母的略语表示寄主菌的物种名。Ecok, Eco R （现在都写成平行，如 EcoR）。EcoRI, EccRU 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶，用罗马字母表示。如属名种名 株名Haemo philus in flue nzae D 嗜血流感杆菌 D 株 EccRI E

4、scherichia coliRIHind in Haem op hilus in flue nsae d 川 Sad （II） Streptomyces achromagenes I （ n ）7、限制性核酸内切酶的作用机制以环状和线形的双链 DNA为底物，在适合的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸 二酯键断开，产生具有 3 - 0H基团和5 P基团的片段。&同裂酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。Hi nd III如Hi nd川和Hsu I。 女0 Xma 和 Sma。9、

5、 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。女口BarHI、Bgl n、Bcl I、Xhon等10、 酶活性单位（U）:在最适反应条件下，一个DNA分子上含有一个酶切位点，60 min内切割1也入DNA所需的酶量称为一个单位。11、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效率，称为星号（*）活性。12、基因工程的其他酶(1)(2)性质用途末端终止法测定DNA序列(3)核酸酶S1催化反应类型：ss-DNA; ss-RNA;13、聚合酶链式反应 PCR :的技术。加入4种物质：(1)(2)(3)(4)作为模板的DNA序列； 与被分离的目的基因两条链TaqDNA聚 合酶

6、；dNT P( dAT P, dTT P, dGT P双螺旋变性区PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因各自5端序列相互补的 DNA引物(20个左右碱基的短 DNA单链);和 dCTP。DNA连接酶:DNA连接酶能催化双链 DNA切口处的5-磷酸和3-羟基生成磷酸二酯键。；DNA聚合酶(Klenow fragment ) 5 T 3聚合酶活性。3 T 5外切酶活性。(失去了 5 T 3外切酶活性) 3端补平 DNA的3末端标记，在3隐蔽端加上标记的 dNTR cDNA第二链的合成 双脱氧第一步 第二步 第三步 第四步 第五步16、PCR扩增特异性DNA片段的

7、主要条件(1) Taq DNA聚合酶(2)引物(primer)2+(6) Mg 的浓度17、PCR的特点(1)特异性强(2)敏感性高18、电泳的基本原理DNA在中性或偏碱性的缓冲液中带负电，在电泳过程中处于凝胶靠负极端的19、电泳迁移率：与DNA分子的构型和大小有关与DNA分子中的碱基组成和顺序无关DNA分子的构象(型)：1型：超螺旋环状(3)快速相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快；20、影响连接反应的因素(1) 插入片段与载体的浓度比例(2) 反应温度 (一般1416C )(3) 反应缓冲液(4)模板(temp late)(5)dNTPs(4)简便n型：带切口环状线性分子次之(1

8、020 倍(5 )可以扩增mRNADNA通过凝胶分子筛向正极端移动 。川型：线状;伸展开环状最慢增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。14、PCR技术的原理(1) DNA模板变性(2) DNA模板与引物复性(3) DNA链的延伸15、PCR的过程预变性(Pre-denature ) 90-95 oC下5分钟，模板 DNA双链完全变性成单链。变性(denature )双链完全变性成单链复性(anneal ) 37-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。 引物的浓度高引物的链短。延伸(extend ) 72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3 端上加上核苷酸。变性进

9、入循环重复 94 oC下1分钟，新合成的 DNA双链又变性成单链模板。第三章基因的克隆载体并在其中得以无性繁殖或表达有意义的1、载体：在基因工程操作中，携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞 蛋白质所采用的一些 DNA分子。2、按功能划分： 克隆载体(cloning vector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。 表达载体(ex pression vector):使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。3、基因克隆载体的必备条件： 多克隆位点；能自我复制 ，有一个复制起点； 选择性标记；安全。DNA分子是否插4、 标记基因的作用：指示外源DNA分子(载体或重组分子)是否进入宿

10、主细胞；指示外源 入载体分子形成了重组子。这种指示也可以是选择性的，也可以是非选择性的，绝大多数为后者。5、 质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。6、 质粒的空间构型：共价闭合环状DNA（ cccDNA）;开环DNA（ ocDNA）；线形DNA（ lDNA）7、 质粒空间构型与电泳速率：scDNA最快、L DNA次之、ocDNA最慢。8、 质粒的不亲和性（不相容性）：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现 象称为质粒的不亲和性或不相容性，这两种质粒称为不亲和性质粒，组成不亲和性群；而彼此能够共存于一个细胞 中称为亲和性质粒，亲和质粒则属于

11、不同的不亲和群。9、天然质粒的局限性：分子量大，拷贝数低；筛选标记不理想；单一酶切位点少或无。10、质粒载体的构建策略：提高质粒载体的拷贝数；引入多克隆位点 在克隆载体中组装“元件”。10、筛选重组子的示意图重点11、a互补：蓝白斑选择原理：X-gal;P-半乳糖苷酶的显色反应； lacZ的a互补。12、穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的 质粒载体。13、Ti质粒载体：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒。14、Ti质粒作为载体的可能性：能够自发地整合到植物的染色体上；能转化多种植物；强启动子

12、强启动子，能启动外源基因的表达。15、天然Ti质粒作载体的缺点：分子量太大（200kb）；限制性酶切位点太多。被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。在大肠杆菌中不 能复制。16、Ti质粒的改造：保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。 取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。加入 大肠杆菌的ori和选择标记。加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。17、 Ti载体的类型：共整合载体一一需要同源重组才能插入外源基因；双元载体一既有大肠杆菌复制起点也有 农杆菌

13、复制起点，是个穿梭载体。18、cos位点：ZDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为佃、天然几噬菌体作为载体的局限性：A噬菌体的非必需区太长；非必需区段上常用的单一限制酶切点少；选择标记基因少；载体的安全性20、A噬菌体载体的构建：构建策略：删除A噬菌体的非必需区，在这个非必需区内制造限制酶切点，删除酶切点；在非必需区引进选择标记基因。建立ZDNA重组分子体外包装系统21、 cosmid载体（粘粒）：一类由人工构建的含有 入噬菌体 DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体， cos site carry ing vectors。22、酵母人工染色体： YAC的特点

14、：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为 230kb-1700kb。（3）构建原理，按染色体结构构建。 YAC的组成结构：（1）着丝粒区（ 的标记基因；（6）在细菌中操作；MCS；引入抗性标记基因；克隆载体DNA分子应尽可能小；T-DNA的opine合成酶基因上游有一个cos位点。ZDNA必需区段上常用的限制Cen）;（2）端粒（Tel）；（3）复制起点（Ori）;（4）克隆位点；（5）在酵母中第四章目的基因的制备DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与话当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和无性扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，也称为基因文库。2、

15、基因组文库构建的一般步骤：基因组DNA片段的制备；载体的准备一一相应的酶切，脱磷酸化等处理阻止载体自连:载体与基因组 DNA片段的连接一一粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物加尾；转化细胞和克隆选择。3、 cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成 cDNA；再将这些 cDNA与载体连接；转入细菌细胞中进行保存和扩 增，称 cDNA文库（cDNA library）,也称基因文库（ gene library）。1、基因组文库：将某种生物整个基因组4、cDNA文库的特点： 以mRNA为材料，是 RNA病毒进行基因克隆的唯一途径。 不含内含子序列，可以在细菌中直接表达。 克隆数比DNA文库小的多，容

16、易筛选。 常来自结构基因，包含了所有编码蛋白质的基因，筛选的假阳性率低。 结构基因的表达具有器官、代谢阶段特异性，由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。 在同一个cDNA文库中，不同类型的 cDNA分子的数目是大不相同的，表现不均匀性。5、不对称 PCR （asymmetric PCR）目的：扩增产生特异长度的单链DNA。，其最佳比例一般是50:1或100:1,关键是限方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物制性引物的绝对量。6、 差别杂交：需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同 mRNA提取物,以两种总 mRNA探针

17、平行杂交，对有表达目的基因的总mRNA反转录构建的 cDNA文库进行筛选。7、差别杂交的局限性：重复性 杂交灵敏度低，对于低丰度的 mRNA尤为明显；工作量大，需大量的杂交滤膜和鉴定大量的噬菌斑； 差，两套平行滤膜之间的 DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。mRNA消减8、消减杂交： 原理：通过 DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建消减文库的方式来分离目的基因。有 杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中差异表达的基因，后者适合克隆两样本特异性存在的基因。PCR 扩增（mRNA differential dis play RT-PCR ,9、 mRNA差异显示 PCR（ DD

18、 RT-PCR:用3 -端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链：用 3 -端锚定引物和 5- 端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行DDRT-PCR，在标准的序列胶中电泳 2-3小时，可显示出 50-100条长度在 100-5000 bp之间的 DNA条带。再以新克隆为10、染色体步移（ chromosome walking）:首先以已知基因或分子标记为探针从基因组文库中筛选与其有共同序歹U 的克隆，再以该克隆为探针从文库中筛选与其有部分重叠序列而且更靠近目的基因的新克隆，同理， 探针依次筛选新克隆，直至所需克隆的目的基因。11、基因芯片技术（gene ch ip特点：减

19、少误差；微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率；自动化：降低成本，保证质高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读；多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确 性， 量。第五章目的基因导入受体细胞DNA体外连接应注意的事项： 插入片段与载体的酶切位点互补1、 DNA插入的方向正确 插入基因的开放阅读框（ORF正确 （1）DNA定位插入载体 （2）起始密码 防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体2、大肠杆菌受体细胞的选择避免与受体基因组进行同源重组，便于重组DNA独立存在避免修饰和降解，使重组DNA稳定存在易于转化或转导：提高细胞的通透

20、性，较高的转化率有明显的选择性差异，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工，有利于真核基因表达防止感染，安全性高，无致病基因 重组缺陷型： 限制缺陷型： 遗传互补型： 感染缺陷型：3、感受态大肠杆菌的制备制备原理：当细菌处于0C、二价阳离子（如 Ca2+、Mg+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态； 此时转化混合物中的 DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在 42C短时间热冲击后吸附在细胞表面而利于进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。4、外源DNA导入细菌的几种方法（1）转化 （2）转染（3）转导5、重组质粒导入受体的转化方法（1）

21、热激法或热休克转化法（2）电转化法（3）平板培养细菌6、重组DNA导入真核细胞（1）酵母细胞（2）植物细胞（3）哺乳动物细胞利用原生质体进行转化农杆菌介导法电击法磷酸钙沉淀法脂质体 利用Li +盐进行转化 基因枪法（lipofectin ）载体法显微注射法DEAE-葡聚糖转染法7、重组体克隆的筛选和鉴定遗传表型直接筛选法DNA电泳检测法 转译筛选法真核生物常用的重组基因选择方法8根据载体的抗药性标记进行筛选PBR322抗菌素标记选择（图已省-打出来黑的） 四环素抗性基因 氨苄青霉素抗性基因 P-半乳糖苷酶显色反应选择法9、核酸杂交检测法核酸杂交检测法免疫化学检测法DNA序列测定原理根据毛细血管

22、作用的原理，使在凝胶电泳中分离的 DNA或 RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段, Norther n hybridization原理指根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分离的或RNA探针进行杂交，以检测被转移 Dot blot hybridizati on原理DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链 成为DNA印迹杂交技术。也称 Southern杂交RNA转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNARNA片段，称为 RNA印迹杂交技术，也称为 Northern 杂交（Northern blot ） Souther n hybridizatio n在杂交的

23、基础上发展起来的用于快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸样品直接转移到适当的滤膜上，然后进 行杂交检测。原理 Colony and pl ague hybridizati on将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，使溶菌班变性的DNA同滤膜原位结合，然后进行杂交测验。杂交后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目标基因序列（与 探针同源）的菌落或噬菌斑。所以，有时也称菌落（噬菌斑）原位杂交。11、酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理：一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondary antibody）: 与一抗的特异性

24、结合。，再通过比色酶联（enzyme-link ）:二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光） 测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。12、一般克隆与筛选策略uDNA XitlSt J=I=IF6 II lEaaBH13、HAT法原理选择培养基中有次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷 ,培养基中的氨基喋啉阻断细胞核苷酸的全程合成，但启动以次黄嘌呤 为底物进行核苷酸的补救合成途径， 不受氨基喋啉的抑制，另外培养基中的胸苷可通过胸苷激酶的作用合成核苷酸, tk +能合成核苷酸，而tk不能合成而死亡。14、二氢叶酸还原酶基因（DHFR （看图背原理）TK轻竽（kTK-

25、dCTTFt K培养(1) 选择原理 二氢叶酸还原酶的必要性DHFto胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。 补救！DHFR细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。 胸苷和次黄嘌呤，DHFR-细胞可通过补救合成途径维持生长。 胸苷和次黄嘌呤补救无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时， 胸苷和次黄嘌呤分别补救：:真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存，不需要不能在无胸苷和次黄嘌呤的培养基中生存。当加入 需要补救！(2)选择过程宿主细胞DHFF!田胞株(不能在无核苷酸的培养基中生长)无核苷酸的培养基透析除去血清中的

26、内源性核苷酸，以免补救。氨甲喋啉“加压”添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR勺补救作用，可提高选择。载体标记DHFf基因。只有转入 DHFf基因的细胞才能生存。需要胸苷和次黄嘌呤补救!15、报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。16、几种常用的报告基因(1)(2)(3)17、大肠杆菌的 3 -D-葡萄糖醛酸糖苷酶(3 -D-glucuronidase , GUS;细菌和萤火虫的荧光素酶(luciferase , luc)；水母绿色荧光蛋白(GFP基因(Green Fluoresce nt P rotein)。DNA序列测定的方法化学降解法

27、测序(1)原理：一个末端标记的 DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。造成碱基的特异性切割，由此产生的一系列具有不同长度的DNA寡聚核苷酸链，经凝胶电泳分离和检测，读出核苷酸序列。(2)双脱氧链终止法测序原理：(1)DNA聚合酶在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3 -OH末端，能利用单链的 DNA作为模板合成出准确的DNA互补链；(2)如果加入双脱氧三磷酸核苷 (ddNTP),由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而终止DNA链的延长。即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMF残基

28、为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA从而读取DNA的核苷酸序列。18、双脱氧终止法测序反应体系包括： DNA聚合酶 单链DNA模板 引物，通常由20-23个碱基构成，G+C=12 A+T=8到11, Tm=60-68C，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构Mg2+ 4 种 dNTP(dATP,dGTP,dCTP和 dTTP) 4 种 ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和 ddTTP)第六章外源基因的表达1、外源基因的表达系统：基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得 到了克隆的基因或 cDNA后

29、，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行 表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。2、外源基因的有效表达关键：起始转录。3、mRNA的延伸与稳定性：外源基因的有效表达的关键：保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在。构建载体需考虑因素：避免非特异性终止，加入抗终止序列；加入正常转录终止序列，减少DNA反向转录为反义 mRNA的机会； 选择受体菌 Rnase缺失（原核）；加入poly（A）的信号序列AAUAAA有利于mRNA的正确加工（真核）。4、表达蛋白在细胞中的稳定性几个方面考虑：融合蛋白，外源蛋白与受体蛋白有良好的杂合构像；分泌蛋白， 外源蛋白能分泌

30、到细胞周质腔或直接分泌到培养基； 包涵体，外源蛋白以包涵体的形式存在与于受体细胞；选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统5、融合蛋白的优点：融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。原核蛋白 部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。目的蛋白溶解性好，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构 象，且大多具有水溶性。6、分泌蛋白的优点：目的蛋白稳定性高；目的蛋白易于分离；目的蛋白末端完整。7、包涵体形式的优点：能简化外源基因表达产物的分离操作；能在一定程度上保持表达产物的结构稳定8、启动子：能与 RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的 DNA序列。PCR扩增法9、启动子的分离：随机克隆法；聚合酶保护法；过滤膜结合法；10、随机克隆法：选用适当的核酸内切酶消化切割的染色体DNA分子；接着将切割产生的 DNA限