第十三章免疫学技术概论

1、第十三章,免疫学技术概述,目的与要求,1,了解最新的免疫学诊断技术以及细胞免疫技术的,种类与用途,2,掌握常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响,因素,3,掌握生物技术公司常用的免疫制备技术,4,了解免疫学技术的应用及其发展趋向,难点与重点,重点：常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因,素；生物技术公司常用的免疫制备技术,难点：常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因,素,免疫学技术是指利用免疫反应的特异性原理，建立各,种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法，包,括,用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术，或称免疫检,测技术，这类技术一般都需要血清进行试验，故又称为免,疫血清学反应或免

2、疫血清学技术,用于研究机体细胞免疫功能与状态的细胞免疫技术,用于建立免疫检测方法的免疫制备技术，如抗体或抗原,的纯化技术、抗体的标记技术,E,玫瑰花环实验,正常人外周血中,T,细胞在体外能直接和绵羊红细胞,SRBC,结合形成玫瑰花样细胞团。这是因为人的,T,细胞膜上具有能,和,SRBC,膜上的糖蛋白相结合的受体，称为,E,受体。已证实,E,受体是人,T,细胞所特有的表面标志，因此本试验可作为人,外周血,T,细胞的鉴定和计数，同时作为人细胞免疫功能状态,的一个检测指标，也是分离,T,细胞的常用方法之一,免疫标记技术,第,1,节,免疫血清学技术概述,抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结,合反

3、应，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的,抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术,是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术,免疫血清学技术自,19,世纪建立了最早和最简单的,凝集试验开始，不断发展，尤其是近,20,余年来，各,种新方法、新技术层出不穷，应用面也日益扩大,已深入到生物学科的各个研究领域,免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为,凝聚性反应,包括凝集试验和沉淀试验,标记抗体,技术,包括荧光抗体、酶标抗体、放射性同位素标记,抗体、化学发光标记抗体技术等,有补体参与的反,应,补体结合试验、免疫黏附血凝试验等,中和反,应,病毒中和试验等,等已普遍应用的技术，以及免,疫复合物散射反

4、应,激光散射免疫测定,电免疫反,应,免疫传感器技术,免疫转印,western b1otting,以及建立在抗原抗体反应基础上的免疫蛋白芯片技,术等新技术,一、免疫血清学技术的类型,凝集试验（血球凝集,凝集试验（细菌凝集,补体结合试验,抗原,抗体反应模式图,凝集反应,沉淀反应,对流免疫电泳,火箭免疫电泳,二、免疫血清学反应的一般特点,一,特异性与交叉性,血清学反应具有高度特异性。这是血清学试验用于,分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。一般血缘越近,交叉反应的程度也越高。除相互交叉反应外，也有表,现为单向交叉的，单向交叉在选择疫苗用菌,毒,株时有,重要意义,天花,牛痘,二,抗原与抗体结合机理,抗原和

5、抗体的结合为弱能量的,非共价键,结合，其结,合力决定于抗体的抗原结合位点与抗原表位之间形成的,非共价键的数量、性质和距离,由此可分为,高亲和力,中亲和力和低亲和力抗体,二,抗原与抗体结合机理,抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这一过程受,物理、化学、热力学的法则所制约，结合的温度应在,0,40,pH,在,4,9,如温度超过,60,或,pH,降到,3,以下,时，则抗原抗体复合物又可重新解离。利用抗原抗体既,能特异性地结合，又能在一定条件下重新分离这一特性,可进行,免疫亲和层析,以制备免疫纯的抗原或抗体,抗原与抗体在适宜的条件下就能发生结合反应。但,对于常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补,

6、体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结,合反应才出现凝集、沉淀等可见反应结果，在最适比,例时，反应最明显。这种,因抗原过多或抗体过多而出,现抑制可见反应的现象，称为带,zone,现象,二,抗原与抗体结合机理,为了,克服带现象,在进行,血清学反应,时，需将,抗原,和抗体作适当稀释,通常是固定一种成分而稀释另一,种成分。为了选择抗原和抗体的最适用量，也可同时,递进稀释抗原和抗体，用综合变量法进行方阵测定,二,抗原与抗体结合机理,三,免疫血清学反应的影响因素,影响免疫血清学反应,的因素主要有电解质、温度,pH,值等,1,电解质,特异性的抗原和抗体具有对应的极性基,羧基、氨基等,它们互相吸附后

7、，其电荷和极性被,中和因而失去亲水性，变为憎水系统。此时易受电解,质的作用失去电荷而,互相凝聚、发生凝集或沉淀反应,因此，需在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反,应。故,血清学反应一般用生理盐水作稀释液,标记抗,体技术中，用磷酸盐缓冲生理盐水,PBS,作稀释液,2,温度,在一定温度下，将抗原抗体保温一定时间，可,促使两个阶段的反应。较高的温度可以增加抗原和抗体,接触的机会，从而加速反应的出现。将抗原、抗体反应,通常在,37,培养箱或水浴,也可在室温下进行；亦可,用,56,水浴反应更快。有的抗原或抗体系统在低温长时,间结合反应更充分，如有的补体结合反应在冰箱低温结,合效果更好,三,免疫血清学反

8、应的影响因素,影响免疫血清学反应,的因素主要有电解质、温度,pH,值等,3,酸碱度,血清学反应常用,pH,为,6,8,过高或过低的,pH,值可使抗原抗体复合物重新离解。如,pH,值降至抗原,或抗体的等电点时，可引起非特异性的酸凝集，造成假,象，出现假阳性,三,免疫血清学反应的影响因素,影响免疫血清学反应,的因素主要有电解质、温度,pH,值等,第,2,节,细胞免疫技术的种类与用途,细胞免疫技术是指与细胞免疫有关的各种检测技术,包括对其,免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析,由于,人们越来越认识到细胞免疫在肿瘤、胞内菌感染、病毒,感染等疾病免疫中的重要性，使近几年来细胞免疫技术,在医学和兽医学研究与

9、临床中应用越来越广,第,2,节,细胞免疫技术的种类与用途,根据被检测的物质性质不同，可将,细胞免疫技术,分为,淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能测定技术和细,胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验,等,4,大类,CIK,是,cytokine induced killer,的缩写，最初是指在正,常人体外周血中只占,1,5,的,cd3+cd56,的,T,淋巴细,胞,目前国内外制备的用于过继免疫治疗的,cik,细胞,实际上是体外扩增出的以,cd3+cd56,cd3+cd8,为主,的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞因子如,IL-2,IFN,及某些单克隆抗体,anti-cd3mcab,的刺激下，由,从外

10、周血,骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体,外培养扩增而成，具有广泛的非,MHC,限制的极强的溶,瘤活性,第,2,节,细胞免疫技术的种类与用途,根据被检测的物质性质不同，可将,细胞免疫技术,分为,淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能测定技术和细,胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验,等,4,大类,生物治疗技术是一种“自身免疫细胞疗法”，它用,人体自身的免疫细胞杀死自己体内的肿瘤细胞”的,原理来治疗肿瘤，是最具优势、最有前景的肿瘤治疗,技术之一。通过提取患者自身外周血中的单个核细胞,在,GMP,超洁净实验室中进行诱导，激活和数量扩增成,树突状细胞,DC,和细胞因子诱导的杀伤细胞,CIK,，然后再回

11、输给病人。这两种细胞对肿瘤细胞,有特异性识别作用，能够广泛识别各种肿瘤细胞。当,DC,与,CIK,细胞联合作用将残留恶性肿瘤细胞完全杀灭,或降低并稳定在一定水平时，即可达到肿瘤的临床治,疗或控制肿瘤的复发和转移,该技术有效修复、增强了人体的免疫系统，减少了,肿瘤细胞转移的几率，无痛苦，无副作用，对于手术,结束后或放疗缓解期患者尤为适合。对于部分乙肝患,者也可采用该方法治疗,生物免疫治疗大致分为五个主要步骤，首先是前期,检查，第二是采集外周血中的单个核细胞，第三步就,是细胞在实验室的激活、诱导与质控，第四步是回输,CIK,细胞的特点,1,增殖能力强，主要效用细胞,CD3+CD56,可增殖,100

12、0,倍,2,杀伤活力强，远优于传统的,LAK,细胞和细胞因子,干扰素、白细胞介素,2,等,3,杀瘤谱广，不受,MHC,限制，具有广谱杀,肿瘤,和病,毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不,受环孢素,A,CsA,和,FK506,等免疫抑制剂的影响，能,抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞,Fas-FasL,凋亡,4,毒副作用小，无严重不良反应。不过长度超过,30bp,的,dsRNA,会由于干扰素,应答引发非特异性基因,抑制,CIK,细胞治疗技术的优势,1,可有清除手术、放化疗,后残余的癌细胞及微小,病灶，预防肿瘤的复发和转移,2,可与放、化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作,用的感染率，提高放化疗的

13、疗效,3,可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生,耐药性的患者的治疗,CIK,细胞治疗技术的优势,4,对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者,能迅速缓解其临床症状，延长生存期；大部分患者,出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤生存的治疗效果,5,由于,CIK,细胞具有免疫调节和体细胞修复作用,在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的,患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽,黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长,或白发变黑等“年轻化”表现，及精神状态或体力,明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量,延长生存期,激光共聚焦显微镜,细胞免疫技术的特点,1,方法复杂，根据不同检测对

14、象需采用不同的方,法，这也是细胞免疫技术发展不快的原因,2,目前逐渐发展用,血清学方法检测细胞免疫,如,用单克隆抗体检测,CD,抗原进行,T,细胞亚群分析，血,清学反应测定白细胞介素和干扰素等，即细胞免疫技,术与血清学技术融为一体,细胞免疫技术的特点,此外，近年来各种先进的检测仪器应用于细胞免疫,技术，如,流式细胞仪,flowcytometer,激光共聚焦显,微镜,等，使免疫细胞表面分子的检测、定位及其功能,的研究有了较大的发展,第,3,节,免疫制备技术的种类,免疫制备技术是指制备与免疫检测有关制剂的各种,技术，包括抗原制备、抗体制备、抗体纯化及抗体标,记等技术,第,4,节,免疫学技术的应用,

15、一、动物疫病诊断,用免疫血清学方法对动物传染病、寄生虫病等进,行诊断，是免疫学技术最突出的应用。应用免疫血清,学技术可以检测病原微生物抗原或抗体，其中酶标抗,体技术，已成为动物多种传染病的常规诊断方法，其,简便、快速，又具有高度的敏感性、特异性和可重复,性，已有许多商品化的酶联免疫吸附试验,ELISA,诊,断试剂盒,二、动植物生理活动研究,动物、植物体中存在一些活性物质，如激素、维生,素等，它们在体内含量极微少，但在调节机体的生理,活动中起重要作用，因此可通过分析测定这些生物活,性物质的含量及变化来研究机体的各种生理功能,如生,长、生殖等,由于这些物质含量极低，用常规检测方,法不能准确测出,二

16、、动植物生理活动研究,目前放射免疫测定和酶免疫技术已能精确测出,ng(10,9g,及,pg(10-12g,级水平的物质，它们已成为测定动物,植物、以及昆虫体内微量激素及其他活性物质、植物,生理和生物防治的重要技术手段,三、物种及微生物鉴定,各种生物之间的差异都可表现在抗原性的不同，物,种种源越远，抗原性差异越大，因此可用区分抗原性,的血清学反应进行物种鉴定与物种的分类等工作。血,清学反应在,细菌、病毒等微生物鉴定,和,血清型及亚型,的分析方面已得到广泛应用。但在动物种源、植物和,昆虫分类方面还是一个新领域,四、动植物性状的免疫标记,通过分析动物、植物一些优良性状,如高产、优质、抗,逆性等,的特

17、异性抗原，然后用血清学方法进行标记选择,育种，是一个很有前途的方向，它比分子遗传标记选择,育种简便,五、生物制品研究,生物制品,如疫苗、诊断制品、免疫增强剂等,的,研究与开发，免疫学技术是必不可少的支撑技术。疫,苗研究中需用血清学技术和细胞免疫技术作为免疫效,力的评价手段。在研究一些免疫增强药物，尤其研究,抗肿瘤药物时，需用细胞免疫技术分析测定它们对机,体细胞免疫功能的增强作用,六、动物疫病致病机理研究,动物传染病的病原从机体特定部位感染，并在特定,组织细胞内增殖，引起致病。采用免疫荧光抗体染色,或免疫酶组化染色技术，可在细胞水平上确定病毒等,病原微生物的感染细胞，还可用免疫电镜技术等，在,亚

18、细胞水平上进行抗原的定位。免疫学技术还可用于,研究自身免疫病和变态反应性疾病的发病机理,七、分子生物学研究,在基因工程研究中，目的基因的分离、表达产物的,特异性检测与定量分析，以及表达产物的纯化等均涉,及到免疫学技术。如可用抗体免疫沉淀分离目的基因,的,mRNA,酶标抗体核酸探针,地高辛核酸探针,检测,筛选基因克隆,免疫转印技术分析,表达产物的特异性,和相对分子质量,ELISA,分析表达量,免疫亲和层析,纯化表达产物、免疫方法分析表达产物的免疫原性,由此可见，免疫学技术是分子生物学研究必不可少的,工具,第,5,节,免疫学技术的发展趋向,免疫血清学技术的发展趋向一直是,高度特异性,高,度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,试验电脑,化、反应微量化、方法标准化和试剂商品化以及方法简,便、快速,第,5,节,免疫学技术的发展趋向,单抗替代多抗体提高特异性；标记技术提高敏感性,结合各种电泳技术提高对抗原分析的分辨能力；结合激,光共聚焦显微镜、电子显微镜进行亚细胞水平、染色体,甚至分子水平上的定位；放射免疫测定、免疫酶标抗体,测定，在专门仪器上配备有电脑和分析软件，使试验操,作和试验结果处理和记录自动化