(整理)聚合酶链式反应(最新整理)

1、精品文档聚合酶链式反应定义 1：用引物和 dna 聚合酶进行体外扩增特定的 dna 区域的一种技术。应用学科：生态学（一级学科）；分子生态学（二级学科）定义 2：体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。应用学科：水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）定义 3：通过 dna 互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增 dna特定序列的方法。应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义 4：由穆利斯(k. b. mullis)于 1988 年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的 dna 快速扩增特定基因或 dna 序列的复制过程的技术。应用学科：遗传学（一级学科）；分子

2、遗传学（二级学科）以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片精品文档概述dna 聚合酶（dnapolymerase i）最早于 1955 年发现，而较具有实验价值及实用性的 klenowfragment of e. coli 则是于 70 年代的初期由 dr. h. klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 taq polymerase),则是于1976 年从温泉中的细菌（嗜热菌）（thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80 年代之

3、后。pcr 最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于 1971 年由 dr. kjell kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似pcr 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的pcr 则于 1983 由 dr. kary b. mullis 发展出的，dr. mullis 当年服务于 pe 公司，因此 pe 公司在 pcr 界有着特殊的地位。dr. mullis 并于 1985 年与 saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，pcr 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后 pcr 技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，

4、成为分子生物学研究的最重要技术。mullis 也因此获得了 1993 年诺贝尔化学奖。pcr 原理dna 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 dna 在多种酶的作用下和接近沸点的温度下加热可以变性解旋成单链，在dna 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，dna 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 dna 的变性和复性，加入设计引物，因为 dna 聚合酶需要一小段双链 dna 来来引导双链的合成。事实上，新合成的链的起点是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸也就是引物在模板链两端的退火位点决定再加上 d

5、na 聚合酶、dntp 就可以完成特定基因的体外复制。但是，dna 聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的 dna 聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约技了 pcr 术的应用和发展。发现耐热 dna 聚合酶-taq 酶对于 pcr 的应用有里程碑的意义， 该酶可以耐受 90以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使pcr 技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，pcr 技术得以大量应用，并逐步应用于临床。pcr 技术的基本原理类似于 dna 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成模板 dna 的变性：模板 dn

6、a 经加热至 93左右一定时间（一般为 2030 秒）后，使模板 dna 双链或经 pcr 扩增形成的双链dna 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 dna 与引物的退火(复性)：模板 dna 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 dna 单链的互补序列配对结合引物的延伸：dna 模板-引物结合物在 taqdna 聚合酶的作用下， 以 dntp 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 dna 链互补的半保留复制链，每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。pcr 反应体系与反应条件1

7、.标准的 pcr 反应体系pcr 反应五要素：参加 pcr 反应的物质主要有五种即：引物(pcr 引物为 dna 片段，细胞内 dna 复制的引物为一段rna 链)、酶、dntp、模板和缓冲液（其中需要 mg2+)。引物的多种设计方法，与 pcr 在实验中的目的决定。但基本原则相同长产物片段与短产物片段引物延伸所获得的新片段最初长短是不整齐的，分为长和短二种。短的是严格的限定在二个引物 5 端之间的，这正是需要扩增的片段，而长的带有不需要的尾巴。长和短产生原因是引物所结合的模板不同而造成的。以一个拷贝的原始模板为例，也就是只有一条待扩增的双链 dna链。长产物片段：在第一个反应周期中，以二条互

8、补的 dna 链为模板， 引物从 3 端延伸。延伸片段的 5 端是一端人工合成的引物。是特定的， 但是 3 端没有特定的止点。进入第二个周期，引物除与原始模板结合外，还要与新和成的链，也就是长产物片段，结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5 端是固定的，就等于这次延伸的片段 3 端被固定了止点。保证了新片段是起点和终点都限定于引物结合位点以内。成为长短一致的短片段。为什么短产物片段按指数增加，长产物片段按算数倍数增加呢？由于半保留复制，不断产生新的长产物片段，引物一结合，就成为短的产物片段。所以长产物片段几乎可以忽略不计。所以 pcr 反应产物不需要再纯化。就能保证足够纯的所需扩增的 d

9、na 片段。用于进一步分析和研究。是按照与扩增区段两端序列彼此互补原则设计的。所以每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，按到方向延伸。每一条新合成的链都具有新的引物结合位点。然后再加热，进入下一轮。随着循环次数递增新和成的引物延伸链急剧增多而成为主要的模板。所以将受到所加的引物末端的限定。其终产物序列是介于二种引物末端之间的区域。最后结果：pcr 所用的酶主要有两种来源：taq 和 pfu。分别来自两种不同的嗜热菌。其中 taq 扩增效率高但易发生错配。pfu 扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择模板即扩增用的 dna，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度

10、必须较高，第二浓度不能太高以免非特异性增加，也就是合成不需要的 dna缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用 hepes 或 mops 缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有 dmso（对 dna 聚合酶 1klenow 片段是有益的，但对于 taq 聚合酶有抑制作用，所以一般反应中不用，但是在复合 pcr 中使用）、甘油（加入 5%15%，有助于复性，尤其对 g+c 含量高和二级结构多的靶序列，以及扩增长片段，也就是大于 1500 碱基对更实用。但是并

11、不对所有的pcr 有益，所以要摸索），氯化甲基四铵tmac，（在反应中加入 1*10 的副五次方1*10 的副四次方 mol/l 的 tmac 可促进 pcr 去除非特异性扩增，而不抑制 taqdna 聚合酶）等，主要用来保持酶的活性和帮助 dna 接触缠绕结构这些辅助成分也叫添加剂，它可以消除引物和模板的二级结构，降低dna 双链的解链温度，使 dna 双链变性完全，可增进 dna 复性时的特意配对，增加或者改变dna 聚合酶稳定性以提高pcr 扩增效率。现已发现不同温度条件下添加剂会影响 taq 酶的半衰期。反应加入小牛血清白蛋白 100 微克每毫升或明胶 0.01%，或者tween20,

12、0.050.1%有助于酶的稳定。加入 5 豪摩尔的二硫苏糖醇也有类似的作用尤其在扩增片段长时，此时延伸时间也长，可加入这些酶保护剂。但是不能加入太多，否则会抑制 pcr 扩增2、pcr 引物设计pcr 反应中有两条引物，即 5端引物和 3引物。设计引物时以一条 dna 单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段 5端上的一小段 dna 序列相同（与 3 撇端互补）；3端引物与位于待扩增片段 3端的一小段 dna 序列互补。？引物设计的基本原则引物长度：15-30bp，常用为 20bp 左右。引物碱基：g+c 含量以 40-60%为宜，g+c 太少扩增效果不佳， g+c 过多易出现

13、非特异条带。atgc 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物内部不应出现互补序列。最低限度是不能连续四个碱基互补两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免 3 端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物 3末端连续 8 个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是 g 和 c。引物 3端不可修饰。应为保守序列。引物的 5 端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点， 用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。v 引物设

14、计软件primer premier5.0 （自动搜索）* voligo6 （引物评价）vvector nti suit vdnasis vomiga vdnastarvprimer3 （在线服务）3、模板的制备pcr 的模板可以是 dna，也可以是 rna。但是 rna 扩增需要先反转录成 cdna 才能进行正常的 pcr 循环。模板的取材主要依据 pcr 的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过 sds 和蛋白酶 k 处理。难以破碎的细

15、菌，可用溶菌酶加 edta 处理。所得到的粗制 dna，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作 pcr 反应模板。？（可以不用纯化而直接当成模板？）此处需要打印：4、pcr 反应条件标准体积：50 到 100 微升 反应缓冲液：50mmol/l 氯化钾，有利于引物的退火。如果大于该数值，则影响抑制 taqdna 聚合酶的活性。有些反应中以 nh4 替代 k，其浓度为 16.6mol/l 10mmol/l 盐酸100ng/ml 明胶镁离子浓度 总应比 dntps 的浓度高。是 1.5mmol/ltaq 聚合酶需要镁离子。镁离子影响引物的退火， 模板与 pcr 产物的温度，产物的特异性，引物二聚体

16、的形成，主要是 pcr 混合物中的 dna 模板，引物和 dntp 磷酸集团可与镁离子结合。所以镁离子含量降低。而 taq 聚合酶需要游离的镁离子最好对每一种引物，每一种模板都进行镁离子的浓度优化。如果引物和模板 dna 原液中含edta 等金属螯合剂也会减低游离的镁离子浓度。最为常用的缓冲体系：1050mmol/l，tris.hcl, tris 是一种双极性离子缓冲液，改变反应液的缓冲能力，如将 tris 浓度加大到 50mmol/l，ph8.9，有时会增加产量。模板：0.1 微克，要根据具体条件加以调整。一般需 10010 的 5 次方拷贝的 dna底物浓度 dntp 以等摩尔浓度配制，2

17、0200umol/ltaqdna 聚合酶 2.5u（100ul）引物 浓度一般为 0.1 0.5umol/l用 0.2 毫升的 pcr 管，反应体积最小为 5 微升，各反应成分按比例缩反应温度和循环次数变性温度和时间 95，30s退火温度和时间 低于引物 tm 值 5 左右，一般在 4555 延伸温度和时间 72，1min/kb（10kb 内）tm 值=4(g+c) +2(a+t)循环次数 :一般为 25 30 次。循环数决定 pcr 扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为 30 个左右，循环数超过 30 个以后，dna 聚合

18、酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。、平台效应： 当引物-模板与 dna 聚合酶达到一定比值时，dna 聚合酶催化反应达到饱和，出现平台效应此处具有酶促反应动力学出现迟早取决于，起始模板的拷贝数，所用 dna 聚合酶的性能， 以及底物 dntp 浓度等因素。平台效应不可避免，但是在其出现之前就可以得到足够数量的目的基因。出现平台期时，pcr 后期循环产物对数积累趋于饱和，并伴随 0.31皮摩尔靶序列的积累。随着循环次数增加，一方面产物浓度太高，一致自身结合，而不与引物结合。或者产物链纠缠在一起，导致扩增效率低。另一方面，酶活下降，引物及 dntp 浓度

19、下降，易发生错误掺入，非特异性产物增加。所以得到足够产物时应尽量减少循环次数。例如当按照常规 pcr 程序合成人类基因时，其标准反应加入 1 微克人类基因组 dna，一般从 1 毫升血样中可以获得 50 微克，。它应含有平均长度为千碱基对的各种单拷贝序列分子的五次方，相当于.皮克的个核苷酸长的靶 序列。经过个循环后，便可产生微克扩增片段。足以满足任何一种分子生物学研究。包括直接的序列测定的需要。实验表明，从微升扩增反应混合物中取微升，经琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下便可观察到清晰的靶条带。有人报道，即便反应混合物中只含有一个拷贝的靶分子，也能有效的扩增。也正因为有如此高的敏锐性，所以任何样品或者实

20、验试剂均应仔细保存，以避免污染。pcr 的循环参数1、预变性（initial denaturation）模板 dna 完全变性与 pcr 酶的完全激活对 pcr 能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的 taq 酶激活时间为两分钟。2、循环中的变性步骤循环中一般 95，30 秒足以使各种靶 dna 序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。3、引物退火（primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的 tm 值为参考， 根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退

21、火温度对 pcr 的特异性有较大影响。4、引物延伸引物延伸一般在 72进行（taq 酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在 1000bp 以上，含 pfu及其衍生物的衍生设定为 1min/kbp。5、循环数大多数 pcr 含 25-40 循环，过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后，反应在 72维持 5-15 分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。（四）pcr 中的污染和假阳性pcr 中污染主要来自1. 样品间交叉污染；2. 先前 pcr 产物遗留（carry-over）现在有些 pcr 因为扩增区很短，即使 taq

22、 酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在 60-65间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。、pcr 检测pcr 反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，eb）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。pcr 反应特点特异性强pcr 反应的特异性决定因素为：引物与模板 dna 特异正确的结合；碱基配对原则；taq dna 聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保

23、守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及 taqdna 聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高pcr 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(g=-6)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，pcr 的灵敏度可达 3 个 rfu(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。简便、快

24、速pcr 反应用耐高温的 taq dna 聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在dna 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，dna 粗制品及 rna 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等 dna 扩增检测。pcr 仪器pcr 仪器的发展 pcr 温度循环至关重要，pcr 扩增仪各参数必须准确。自 perkin elmercetus 公司第一台 pcr 扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售

25、 pcr 扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。为了便于了解和选购适宜的 pcr 实验设备，现将部分国内外 pcr 扩增仪列表如下；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产 1109 型 dna 扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b 体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式 pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节省劳动力的目的。在采用这些仪器作 pcr 试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，

26、以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用 eppendorf 管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响， 这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷 pcr 反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。国内外生产的几种 dna 扩增仪1109 型北京新技术所与军科院联合机械臂变温水浴电子调温400.5ml16400 元/台90a/b 型中科院遗传所机械臂变温水浴电热14000 元/台ptc-51a/b 型军事医学科学院变温气流电子调兼作

27、套式300.5ml12000 元/台dna thermal cycler perkin elmercetus(美) 变温铝块压缩机致冷480.5ml us $ 20000.-thermocycler #60#00#180b.braun biotech (德)变温水浴 98四档电热，自来水冷却601.5ml1001.5ml1801.5ml dm 30000.-automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.(美)变温铝块 25100电热,自来水冷却291.5ml581.5mlus $4985.- us $7980

28、.-grant autogengrant instrumant ltd(美)变温水浴 099电热，自来水冷却或加冷循环器501.5mlor 501.5mlus $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2techne ltd.(英)变温铝块 099三档电热 500w 水冷 100w 540.5ml540.5ml241.5ml3383. 3997. -bioovenbiothrm corp(美)变温气流-150 115v 11a200s of 496plate us $ 2990. -trio-thermo-block tb-1 biom

29、ertra(德) 半导体变温220v320 管分别控温dm12900. -micro cycler e eppendorf(美) 变温铝块220v/100v329 管us $ 3500. -pcr 常见问题pcr 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带pcr 反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用， pcr 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有 taq 酶抑制剂， 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板

30、时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。电泳检测阴性。需注意的是有时忘加 taq 酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 pcr 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看 od 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条

31、带，一条引物无条带，此时做 pcr 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。mg2+浓度：mg2+离子浓度对 pcr 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 pcr 扩增的特异性，浓度过低则影响 pcr 扩增产量甚至使pcr 扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 pcr 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多大体积进行 pcr 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，

32、在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对 pcr 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，引物无法与模板结合，会导致 pcr 反应的失败。极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 pcr 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 pcr 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 pcr 扩增是不会成功的。假阳性出现的 pcr 扩增条带与目的靶

33、序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 pcr 扩增时，扩增出的 pcr 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：属于反应前污染。这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。如提取dna 使用的仪器上残留的杂质 dna 或反应管中残留的 pcr 产物， pcr 操作者的皮肤和头发等，其中 pcr 产物的污染是引起样品交叉污染的主要因素。明胶，taqdna 酶等 pcr 试剂均有可能带有杂质dna，所以也可导致 pcr 反应前污染。这种假阳性

34、可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。或者用 10%的次氯酸钠或者 2 摩尔每升的盐酸浸泡或者擦洗污染源。前者效果更佳。限制性内切酶含高盐溶液，但是要必要时， 可以去除含酶切位点的 dna。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 pcr 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 pcr 方法来减轻或消除。三是 pcr 反应后污染，主要来自 pcr

35、 产物检测过程，如电泳上样， 点杂交点样时加样器吸头之间的污染等。出现非特异性扩增带pcr 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。引物二聚体是一种非模板依赖的双链 pcr 产物。二是 mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 pcr 循环次数过多有关。其次是酶的质和量， 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高

36、退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带pcr 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dntp 浓度过高，mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少 dntp 的浓度。适当降低 mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。克隆 pcr 产物1) 克隆 pcr 产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比 1：8 或 8：1 也行。应测定比值范围。连接用 5ul 2x连接液，50ng 质粒 dna,1weiss 单位的t

37、4 连接酶，插入片段共 10ul。室温保温 1 小时，或 4过夜。在这 2 种温度下，缺t-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温 1 小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需 4过夜。2) pcr 产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。如果引物浓度过高，就会产生引物二聚体。产生引物二聚体原理：反应体系中引物量远远大于模板量。摩尔比为 10 的八次方比、一。如此过量的引物才能确保模板一旦变性就与引物

38、复性，才不会与模板退火。则引物相互碰撞的几率大，一旦形成引物二聚体，则它会非常有效的被扩增，并有可能成为主要的 pcr 产物。一对引物的 3 端互补能促进引物二聚体形成。即使二引物 3 端互补序列在低复性温度，高酶浓度，高引物条件下，再加上循环次数多，任引物均可形成二聚体。所以引物质量要高，且需纯化。冻干引物于-20 摄氏度至少可保存 1224 个月。液体状态于-20 摄氏度保存期为 6 个月。3) 如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？a） 涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。b） 转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效

39、率。例如，将 1ug/ul 质粒 1:100 稀释，1ul 用于 100ul 感受态细胞转化。用 soc 稀释到 1000ul 后，用 100ul 铺板。培养过夜，产生 1000 个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板 dna 的总量。铺板 dna 的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用 10ng dna，用 soc 稀释到 1000u 后含 10 ng dna，用 1/10 铺板，共用 1 ng dna。转化率为：1000 克隆x10（3 次方） ng /铺板1 ng dna ug=10（6 次方）cfu/ug转化 pgem-t 应用 10（8 次方）cfu/ ug 感受态细胞

40、如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。c） 如用 pgem-t 正对照，或 pcr 产物，产生20-40 蓝斑（用指定步骤 10（8 次方）cfu/ug 感受态细胞），表明载体失去 t。可能是连接酶污染了核酸酶。t4dna 连接酶（m1801，m1804，m1794） 质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 t4 dna 连接酶替换。d） 用 pgem-t 或 pgem-t easy 载体，连接 pgem-t 正对照， 转化高频率感受态细胞（10（8 次方）cfu/ug），按照指定的实验步骤，可得 100 个菌落，其中 60%应为白斑，如产生20-40 蓝斑，没有菌落或少有菌落，连接

41、有问题。4) 对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？a） 连接用室温保温 1 小时，能满足大多数克隆，为提高效率， 需 4过夜。b） 插入片段带有污染，使 3-t 缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和 pgem-t 正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使 pgem-t 或 pgem-t easy 载体 3-t 缺失。c） 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受 uv 过度照射，时有发生。uv 过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接， dna 必需重新纯化。d） 带有修复功能的耐热 dna

42、 聚合酶的扩增产物末端无 a，后者是 pgem-t 或 pgem-t easy 载体克隆所需。加 taq dna 聚合酶和核苷酸可在末端加 a。详情查 pgem-t pgem-t easy 载体技术资料（tm042）。e） 高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 sure 细胞 加双或三蒸水至 100uldntp 的质量与浓度 dntp 的质量与浓度和 pcr 扩增效率有密切关系，dntp 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dntp溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1m naoh 或 1m tris。h

43、cl 的缓冲液将其 ph 调节到 7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使 dntp 降解。在 pcr 反应中，dntp 应为 50200umol/l， 尤其是注意 4 种 dntp 的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 pcr 产物的产量。dntp 能与 mg2+结合，使游离的 mg2+浓度降低。因此， pcr 体系中镁离子的加入量要比 dntp 浓度高0.22.5mmol/l。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 pcr 成败与否的关键环节之一，传统的 dna 纯化方法通常采用 sds 和蛋白酶

44、k 来消化处理标本。sds 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，sds 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 k 能水解消化蛋白质，特别是与 dna 结合的组蛋白， 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 pcr 反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 pcr 扩增。rna 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 k 法，要防止 rnase 降解 rna。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 pcr 特异性的较重要

45、因素。变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 dna 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20个核苷酸，g+c 含量约 50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：退火就是复性的意思，如果复性温度太高，dna 链有的还都处于变性，引物就不愿意与之结合。相反，如果复性温度低，dna链都复性，就会增加扩增产量，但是其他非目的基因和模板本身的基因也会增加tm 值(解链温度)=4(g+c)+2(a+t)复性

46、温度=tm 值-(510)在 tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 pcr 反应的特异性。退火也就是复性时间为 2040 秒，时间过短导致延伸不充分，后面延伸步骤中温度升高，会导致引物从模板中脱落，pcr 反应失败。如果待扩增目的 dna 片段含量很少，可在 pcr 前几次循环中适当延长退火时间有利于引物与模板的结合。提高灵敏度。延伸温度与时间：taq dna 聚合酶的生物学活性：7080 150 核苷酸/s/酶分子70 60 核苷酸/s/酶分子55 24 核苷酸/s/酶分子37 摄氏度1.5 核苷酸/s/酶分子高于 8090时， dna 合成几

47、乎不能进行。原因可能是高温破坏引物-模板结合的稳定性taq 酶基因全长 2499 个碱基， 编码出蛋白质分子质量是94000da，长度为 832 个氨基酸。pcr 反应的延伸温度一般选择在 7075之间，常用温度为 72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。pcr 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1kb 以内的 dna 片段，延伸时间 1min 是足够的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10kb 需延伸至 15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。扩增小于 500 碱基对的，20 秒小于 150 碱基对的，则可以省略延

48、伸步骤。因为退火温度下，taqdna 酶活性已足以完成短序列的合成taqdna 聚合酶： 1 无 35 外切酶活性：序列分析表明，taq酶与大肠杆菌聚合酶 1n 端区域高度同源，大肠杆菌聚合酶 i 具有 53 外切酶活性与此区域有关，因此 taq 酶也具有 53 外切酶活性。taq 酶没有 35 外切酶活性，因为没有与大肠杆菌聚合酶 i 的 35 外切酶活性区域同源的序列。pcr 反应中，若发生单核苷酸的错配，taq 酶无校对功能。该酶在 pcr 反应中出现错配的几率是 1/3001/18000,也就是说，经过 25 轮扩增后，扩增产物的序列中每400 个碱基中就有一个碱基对与原始序列不同。这

49、对于大批量产物的分析而言，并不会构成什么严重的问题，因为具有同样错误掺入的核苷酸分子仅占全部参与合成的 dna 分子群体的极小部分。然而，如果如果 pcr 扩增的 dna 片段是用于分子克隆，则核苷酸错误掺入是一个值得注意的问题。每一个克隆来自单一的核苷酸分子，如含有一个或者数个错误掺入的核苷酸，则在该克隆中所有克隆的 dna 都带有同样的“突变”，所以，对于目的是用来克隆的扩增 dna，要测序。以便弄清发生的突变。当然，通过克隆测序以及同一系列独立扩增的 dna 分子进行比较，便能评估 pcr 扩增产物的精确性。所以如 vent 酶等其他扩增反应精确性很高的酶也可以考虑加入。反转录酶活性：类

50、似于反转录酶。在 23mmol/l 镁离子，68 摄氏度时即能发挥此活性。有人报道，在有锰离子加入，活性更佳。如果没有锰离子，就不能反转录 150250 个核苷酸以上的核酸，利用这一特性，可以直接进行 rna 的扩增，是 rt-pcr 简化。taqdna 聚合酶反转录活性的发现和一步法rt-pcr 的建立具有重要的实际意义。1dna 溶液，组织处理样品，细胞间液，或者其他体液中的 rna应该进行处理，否则会出现非特异性扩增产物。2rt_pcr 可以直接用于 cdna 克隆3 可以分析异常的信使 rna，如过量表达，突变，转位，外源基因的表达等4 有助于建立单体系的 rna 扩增和序列分析系统。

51、并实现自动化。非模板依赖的聚合酶活性：taq 酶具有类 dna 末端转移酶的功能，可以再新和成的双链产物的 3端加上一个非模板依赖的碱基。尽管四种碱基均可以被聚合到 3 端，但是 taq 酶对 datp 的聚合能力远高于其他三种。所以，在标准 pcr 反应中，pcr 产物3 端这一非模板依赖碱基几乎总是a。利用这种特性，可以构建 dt-载体来克隆带 da 尾的 pcr 产物，这种非模板依赖的聚合碱基还可以通过大肠杆菌聚合酶的片段处理去掉。即在反应之后，在摄氏度加热分钟灭活 聚合酶。调整镁离子浓度至，加入大肠杆菌聚合酶大片段。室温下作用分钟即可。如反应中，每种为微摩尔每升，则不需再加入影响酶活性

52、的因素：taq 酶活性受许多因素的影响，如镁离子，氯化钾，醋酸铵等。氯化镁浓度在 2.0 毫摩尔每升时酶活性最高，镁离子浓度偏高，则活性收到抑制。pcr 反应中的模板 dna，引物，以及四种寡核苷酸，均可与镁离子结合，所以在不同体系中镁离子浓度要适量调整。50 毫升的氯化钠可提高 taq 酶的活性 2030%。另外，不同变形剂对酶活影响不同。了解这些特性对 pcr 反应条件优化有益处pcr 实验室的建立方法1、实验室布局pcr 实验室按规定需要四间，分别是 1 试剂储存和准备区、2 标本制备区、3 扩增反应混合物配制和扩增区、4 扩增产物分析区， 布局见图 1。pcr 实验室如果使用全自动分析仪，各区域可适当合并，我们建议将扩增区和产物分析区合并为扩增检测区即共三个间