转基因作物种子检测技术研究进展

1、转基因作物种子检测技术研究进展1转基因作物的生产情况及其种子贸易情况从1996年商品化种植转基因作物以来，全世界每年的转基因作物种植面积均以两位数的百分比增长，已由1996年的170万hm2猛增到2006年的102亿hm2，种植转基因农作物的国家从最初的6个增加到22个，累计种植面积达到577亿hm2。lO年间，转基因作物种子的累计全球市场价值(转基因种子的销售价格加上应用技术费用)估计为355亿美元。2006年全球转基因作物种子的销售额(含部分技术费)达615亿美元，占全球商业种子市场价值的21。其中转基因大豆、玉米、棉花和油菜的销售额分别占44、39、14和3。目前在中国市场上销售的转基因

2、作物种子只有转基因抗虫棉种，截止到2006年，中国累计推广国产转基因抗虫棉1 040万hm2，累计销售棉种约10亿kg，销售额约30多亿元。转基因作物生产规模及种子贸易量的飞速增长，显示出巨大的应用价值和商业前景。2开展转基因作物种子检测技术研究的必要性和紧迫性就在转基因作物快速发展、种子销售量节节攀升的同时，由于其本身具有的潜在食品安全问题以及通过转基因逃逸可能给生态系统带来的影响，国际社会对转基因作物的生物安全问题表示出日益强烈的关注。2001年1月，包括中国在内的113个国家(地区)在加拿大签署了联合国生物安全议定书，明确规定消费者有对于转基因食品的知情权。目前已有30多个国家(地区)宣

3、布或者实施对转基因产品(食品)的标识管理制度，并规定了转基因产品中转基因成分的最高阈值，对高于规定阈值的产品，必须进行明确标识。这些政策的出台，要求各国必须具备相应的转基因产品检测技术，能够定性定量检测转基因成分。尽管目前我国还没有转基因种子进口，国内生产经营的转基因作物种子也仅限于棉种，但由于全球转基因作物种植面积逐年增加，转基因种子贸易量不断攀升，进口常规种中混有转基因种子的事件时有发生，这些未经审批流入的转基因种子一旦种植传播，很可能对我国的农业生产带来极大危害。同时，随着转基因作物品种的大量推广应用，种子市场上必然会出现以假充真、以次充好等假劣转基因种子的高价销售问题；而且由于转基因品

4、种随繁育世代的增加可能会发生遗传稳定性的变化，如基因分离、漂移等现象，使转基因种子的纯度降低。因此，很有必要开展转基因种子检测技术的研发工作并逐渐予以标准化，这对于保护种子生产者、经营者和使用者的合法权益，保障我国农业生产和农业生态系统安全稳定具有十分重要的意义。3转基因作物种子检测技术研究进展目前国内外开展的转基因检测技术研究主要是针对转基因植物及其产品成分的，而这些技术方法也被广泛用于检测转基因作物种子中的转基因成分及含量。检测技术主要有生物化学测定、蛋白质分析、PCR检测、分子杂交和PCR-ELISA检测等五种。31生物化学测定法生物化学测定是通过检测转基因作物某一特性的缺失或存在，来判

5、断样品是否为转基因产品。根据检测目标可以分为检测外源抗性基因和检测外源标记基因两种。311检测外源抗性基因，如抗除草剂基因、抗虫基因等在转基因作物中的表达。将待测种子播种在含有除草剂的培养基上，或种子正常播种后，用适宜浓度的除草剂处理幼苗，通过种子萌发情况和幼苗性状表现判断转基因品种和非转基因品种；或者将植株幼苗叶片喂食幼虫，通过测定死亡率来判断是否为转基因植株。大量实验证明，该方法具有简单、易操作、检测周期短等优点，是对大量转基因种子样品进行初筛检测的最佳方法。312检测外源标记基因在转基因作物中的表达。主要利用GUS组织化学染色法、NPT培养法、卡那霉素培养法和NPT叶片涂抹法对各种转基因

6、种子进行鉴定，实验证明该法操作简单、成本低廉、易于判断且准确性较高。32蛋白质分析法蛋白质分析法又称免疫分析法，是检测通过基因修饰获得的外源蛋白质最常用的方法。该法利用抗体与抗原的特异性结合来检测外源蛋白的存在，主要分为酶联免疫分析法和侧向流动免疫试纸法两种。321酶联免疫分析法酶联免疫反应又称为ELISA反应，该法具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，可以定性和定量检测特异蛋白质，具有简便、快速、费用低等优点。但由于可能存在表达的组织特异性和技术要求过高的问题，该法比较适宜已开发出商业化试剂盒的特定外源蛋白的检测。322侧向流动免疫试纸法该法是最近15年发展起来的，起初主要用于医学领

7、域。测定时，将试纸条放在待测样品抽提物中，510 min就可得出定性检测结果，按照合适的采样步骤，可以在给定的一批样品中以99的置信水平检测出少于O15的转基因成分。该法具有快速、简便、适合野外操作等优点，可用于检测种子中的转基因成分。美国检测StarLink玉米中的Cry 9 C蛋白的试纸条已成为美国官方的检测方法。该方法的局限性在于一种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。33 PCR检测法PCR检测法是目前检测转基因种子应用最普遍的方法，根据检测策略可将其分为通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测

8、四类(见图1)，按照检测原理则可将其分为定性PCR检测和定量PCR分析两类。331根据检测策略分类(1)通用元件筛选PCR检测：主要以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩增片段，例如CaMV 35s启动子、NOS终止子等通用元件以及NPTII、Hpt、GUS等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因产品的研究与生产中，因此该法只能用于转基因产品检测的初步筛选。至于导人了何种基因，还需作进一步的鉴定。(2)基因特异性PCR检测：以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段，例如常用的Cry 1 Ac、Cry 1 A6和CP 4一EPSPS等基因。目前商业化种植的转基因产

9、品的外源目的基因基本都已建立了这种检测方法。但是，该法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物及其品系。(3)构建特异性PCR检测：以外源插入载体中两个元件连接区的DNA序列为检测目标，该法具有相对较高的特异性，目前商业化种植的各种转基因植物基本都已建立这种检测方法。但是由于转基因外源表达载体可能以一个、两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同的植物基因组中，从而形成具有相同农艺性状的不同转基因品系，因此构建特异性检测方法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。(4)品系特异性PCR检测：以外源插入载体与植物基因组的连接区序列为检测目标。由于每一个转基因植物品系都具有特

10、异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。鉴于上述4种转基因产品检测策略的优缺点，品系特异性检测已经成为目前转基因作物种子检测研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。到目前为止，已有相当部分的转基因植物品系的品系特异性检测方法的报道，例如转基因RoundupReady大豆、转基因玉米品系(Mon 810、NK603、T25、Bt ll、Mon 863、StarLink、GA 2l和Bt 176)、转基因油菜GT73等。332根据检测原理分类(1)定性PCR检测：定性PCR检测是利用适当引物对样品DN

11、A进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色的检测方法。简单PCR检测：目前针对全球商业化转基因作物种子(大豆、油菜、玉米、棉花和烟草等)的定性PCR检测方法研究报道很多，主要以CaMV35 S启动子基因、NOS终止子基因、CP4一EPSPS基因和BAR基因等为检测目标，建立定性检测转基因大豆、水稻、油菜等作物种子的方法，并在实际工作中得到了较好的运用。复合PCR检测：复合PCR检测，就是将两对或者两对以上的引物在同一个反应管中进行扩增，达到同时检测两个或两个以上目的DNA片段的目的。目前，很多研究人员建立了应用一次PCR反应同时扩增检测转基因作物种子中两种或多种外源基因的复合PCR方法

12、。由于该法具有检测效率高、费用低，且灵敏度高的优点，已在转基因作物种子的检测中得到广泛应用驯。但该法建立的难点在于PCR引物的设计和PCR反应条件的优化和每对引物反应效率不一致，因此在建立复合PCR检测体系时必须考虑上述因素。巢式PCR检测：巢式PCR，又称为套式引物PCR，通过利用内外引物和两次PCR扩增可以大大地提高PCR检测的灵敏度，同时增加了特异性扩增，提高了扩增效率。巢式PCR对转基因食品样品的快速检测非常有效，但目前在转基因种子检测中报道较少。(2)定量PCR分析(quantitativePCR)：目前很多国家对转基因成分含量均设置了相应的阈值，如欧盟规定只要产品中转基因成分超过O

13、5，就必须标识，O9以下才允许进口；韩国规定5为转基因成分的标识阈值，日本为3。因此对转基因产品进行定量标识和定量分析，是国际贸易发展的需要。在此背景下，定量PCR技术应运而生了。传统定量PCR：利用该法检测时，由于DNA浓度与PCR信号之间并非线性关系，并且不同分析之间这种关系不恒定，因此用这种方法进行定量有一定的局限性，只能称作半定量，较少应用于转基因种子检测中。定量竞争PCR：此方法需要利用基因重组技术构建标准竞争DNA，且每次检测需要作多个标准样品的对照，不太适合高通量的转基因种子样品检测。实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累

14、积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR仪在传统PCR仪的基础上增加了荧光检测系统和计算机软件分析系统，可以在PCR过程中连续地检测荧光信号的变化并传递给计算机分析系统进行数据处理。由于实时定量PCR中反应信号的检测贯穿于整个反应过程，检测结果准确、检测效率高，适于高通量快速分析，是目前转基因作物种子检测技术的发展新方向。由于采用的荧光基团发光原理的不同，该方法又可以分为很多种。其中SYBR Green I荧光染料的优势在于能检测任何dsDNA序列的扩增，不需设计探针，检测方法简便、检测成本低。然而由于SYBR Green I能和任何dsDNA

15、结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。TagMan探针法是一种高度特异性的定量PCR技术，探针只与模板特异性结合，实现了荧光信号积累与PCR产物形成完全同步。因此该法因其探针简单、特异性强、准确性高得到最广泛的应用。34分子杂交法分子杂交是将核酸或蛋白质与标记过的探针杂交检测转基因生物的方法，分为核酸分子杂交、蛋白质杂交和基因芯片技术3种。341核酸分子杂交将提取到的DNA或RNA与特定探针进行杂交，从而鉴定植物基因组中是否含有外源基因或目标基因在植物细胞内是否正常转录。该法准确度高、特异性强，但杂交程序繁琐，对实验技术条件要求较高，不适宜高通量的

16、转基因种子检测。342蛋白质杂交该法将蛋白质的电泳、印迹、免疫测定融为一体，对蛋白质进行免疫学测定，具有很高的灵敏性，可以从植物细胞的提纯蛋白质中检出15 ng的特异蛋白质，是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法，但其操作较繁琐，费用较高，不适于口岸快速、大量种子样品的检测。343基因芯片技术在传统DNA杂交基础上采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效检测的方法。目前国内的基因芯片技术正处于发展阶段，应用于转基因作物种子检测的报道还不多。35 PCR

17、ELISA检测法新近发展起来的PCREuSA是利用免疫学方法检测PcR产物，将PcR的高效性和EuSA的高特异性结合在一起。与常规PCR相比，增加了杂交步骤来检测PCR产物的特异性，用酶联反应来放大信号，提高了检测的准确性、灵敏度及自动化程度。36各种检测方法的比较生物化学检测法成本低，技术要求不高，但只能对已知转入某种抗性基因或具有某个标记基因的转基因作物种子进行检测，且检测周期比较长，结果的准确性也受种子发芽率的制约。表1目前我国已发布的可用于转基因作物种子检测的方法标准序号标准号标准名称1GBT 1949512004转基因产品检测通用要求和定义2GBT 1949522004转基因产品检测

18、实验室技术要求3GBr 1949532004转基因产品检测核酸提取纯化方法4cBT 1949542004转基因产品检测核酸定性PcR检测方法5GBr 194955-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法6GBr 1949562004转基因产品检测基因芯片检测方法7GBT 194957-2004转基因产品检测抽样和制样方法8GBT 194958-2004转基因产品检测蛋白质检测方法9农业部869号公告一32007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt ll及其衍生品种定性PcR方法10农业部869号公告-4-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜Ms 1、RF 1及其衍生

19、品种定性PcR方法11农业部869号公告一52007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜Ms 8、RF3及其衍生品种定性PcR方法12农业部869号公告-62007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜Ms 1、RF2及其衍生品种定性PcR方法13农业部869号公告一720(17转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Tc 1507及其衍生品种定性PCR方法14农业部869号公告一82007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米BI 176及其衍生品种定性PcR方法15农业部869号公告-92007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON 810及其衍生品种定性PCR方法16农业部

20、869号公告一10-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米NON 863及其衍生品种定性PcR方法17农业部869号公告一ll-2007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜GT73及其衍生品种定性PcR方法18农业部869号公告一12-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米GA 21及其衍生品种定性PcR方法19农业部869号公告一132007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK 603及其衍生品种定性PcR方法20农业部869号公告一142007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米T2h5及其衍生品种定性PcR方法21农业部953号公告一1-2007转基因植物及其产品成

21、分检测抗虫玉米Bt 10及其衍生品种定性PcR方法22农业部953号公告-2-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米cBH 351及其衍生品种定性PcR方法23农业部953号公告一3-2007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜T45及其衍生品种定性PcR方法24农业部953号公告-42007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Oxy-235及其衍生品种定性PCR方法25农业部953号公告一62007转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因水稻定性PcR方法26NYT 6722003转基因植物及其产品检测通用要求27NYT 6732003转基因植物及其产品检测抽样28NYT 67420

22、03转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化29NYT 675-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCP方法30sNT 1194-2003植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法31sNr 1196-2003玉米中转基因成分定性PcR检测方法32sNT 1197-2003油菜籽中转基因成分定性PcR检测方法33sNr 1198-2003马铃薯中转基因成分定性PcR检测方法34sNT 1199-2003棉花中转基因成分定性PCR检测方法35SNr 12002003烟草中转基因成分定性PCR检测方法36sNT 12042003植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PcR定性检验方法37sNT 11

23、95-2003大豆中转基因成分定性PcR检测方法38YcT 150一2002烟草种子转基因的测定蛋白质分析法具有灵敏度高、专一性强、快速简便等优点，但只能检测某种特异性蛋白，当样品中同时含有几个相同的转化事件时，则无法对转基因作物品种进行区别鉴定。外源蛋白在不同植物、同一植物不同组织中的表达量差异很大，很难进行准确定量。此外，制作抗体需要较高的实验技术水平和较贵的仪器设备，开发成本较高。因此该方法适用于已经商业化的特定蛋白检测。PCR检测技术可对所有的DNA导人事件作定性检测，且具有快速、准确、灵敏度高、适合单粒种子样品分析等优点，因而得到越来越广泛地应用。但该技术受到的干扰因素较多，如DNA纯度、实验室污染、移液器误差、反应体系中存在抑制因子等均会影响结果的准确性，不同试验室间的判断结果往往会有偏差。实时定量PCR法检测灵敏度最高、假阳性低、自动化程度高，不需要开盖，反应、检测一步完成，有效防止了污染，保证了检测结果的准确性，但该法必须使用专门的定量PCR仪器，价格昂贵，检测成本高。Southern、Northern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因的情况，但这些分子杂交技术操作繁琐，费用高，不适合大批量种子样品的检测；DNA芯片技术具有PCR的优点，同时可以对大量样品进行筛选和鉴定。然而，由于在同一芯片内部及不同芯片数据比较等问题，D