一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定

1、一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定赵红玉,徐磊魏溪涓邓敏娟王芳,易可可(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,杭州;通讯联系人,Email:wffsymailzaasaccn)IsolationandCharacterizationofaNovelRootTipspecificPromoterinRiceZHAOHongyu,XULei,WEIXijuan,DENGMinjuan,WANGFang,YIKeke(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua,C

2、hina;InstituteofVirologyandBiotechnology,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou,China;Correspondingauthor,Email:wffsymailzaasaccn)ZHAOHongyu,XULei,WEIXijuan,etalIsolationandcharacterizationofanovelroottipspecificpromoterinriceChinJRiceSci,():Abstract:Toobtaintherootspecificpromotersinrice,ar

3、ootspecificgeneOsgwasselectedbyanalyzingthepublicmicroarraydataandfurtherconfirmedbyRTPCRTodeterminetheexpressionpatternofthenovelpromoter,theputativepromoterwasisolatedandfusedwiththeGUSreportergenetotransformintothericevarietyNipponbareSubsequentGUSstainingofthetransgenicplantsshowedthattheOsgprom

4、oterwasonlyactivatedinriceroottipUsingthisroottipspecificpromoter,wecharacterizedthefunctionofaubiquitouslyexpressedgeneOsSRGinrootdevelopmentTheabsenceofOsSRGledtoashortrootphenotypeinthesrgmutant,theroottipspecificexpressionofGUSOsSRGinsrgplantssignificantlyreversedtherootgrowthdefect,indicatingth

5、attheexpressionofOsSRGinroottip,notinshoot,isimportantforrootdevelopmentinriceThepresentstudyshowedthatOsgpromoterishighlyactiveintheroottipandcanbeusefulfortheroottipspecificexpressionoftargetgenesandgenefunctionanalysisinricerootKeywords:rice;promoter;roottipspecificpromoter;GUSreportergene;SRGgen

6、e赵红玉,徐磊,魏溪涓,等一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定中国水稻科学,():摘要:为了挖掘水稻中的根系特异表达启动子,通过生物信息学分析和RTPCR验证获得个在根尖特异表达的水稻基因Osg.用分离出的该基因上游启动子,与GUS报告基因构建表达载体并转化到受体水稻日本晴中.通过对转基因后代中不同组织器官中的GUS活性检测,证明该启动子在水稻根尖特异性强烈表达.结合该根尖特异表达启动子,我们分析了一个在水稻地上部及地下部都组成表达的功能基因OsSRG对水稻根系发育的贡献.该基因的缺失导致水稻突变体srg根系变短,而利用分离的根尖特异性Osg启动子在根尖驱动GUSOsSRG的表达,能回复突

7、变体根系生长,表明OsSRG在根尖的表达足以影响水稻根系生长,而在地上部的表达与根系发育无关.本研究表明Osg启动子是一个水稻根尖特异表达启动子,利用该启动子可以控制目标基因在水稻根尖特异表达,可用于水稻根系基因功能的研究.关键词:水稻;启动子;根尖特异表达启动子;GUS报告基因;SRG基因中图分类号:Q;S文献标识码:A文章编号:()作为基因表达调控的重要元件,基因上游启动子控制着基因在特定组织、发育阶段以及环境条件下的表达.高活性的启动子在植物基因功能研究和遗传育种中具有很好的应用前景.目前在植物基因工程中应用最为广泛的一类启动子是组成型启动子,如花椰菜花叶病毒(CaMV)的S启动子和根癌

8、农杆菌Ti质粒的NOS启动子,.不过,相较于外源病毒启动子潜在的生物非安全性,来源于植物本身的高活性组成型启动子在转基因应用中更具有优势.但是,植物內源性的组成型启动子往往会造成目的蛋白在植株体内过量积累,从而影响植物正常的生长发育.因此,分离和获得组织专收稿日期:;修改稿收到日期:.基金项目:国家自然科学基金资助项目(,);浙江省自然科学基金资助项目(LYC).中国水稻科学(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn一性表达特性的启动子,对植物功能基因研究和作物遗传改良显得尤为重要.在前人的研究报道中,已获得一些不同植物的组织特异性启动子.例如

9、玉米叶片特异性CPdK启动子,水稻胚乳特异性ISA启动子和花药特异性Tsp启动子,.根系是植物吸收水分和养分的重要器官,但是与植物地上部组织特异性启动子的研究报道相比,根系特异性启动子的报道仍然不多.目前已知的有烟草TobRB启动子,拟南芥PYK启动子和水稻RCc启动子.研究发现,利用这些根系启动子在植物根系特异表达目的基因,不仅能改良植物根系,还能提高植物耐受能力.例如,利用拟南芥PYK启动子驱动CKX基因在根部特异表达,使转基因植株形成的根系比野生型更大;在水稻中,与组成型GOS启动子驱动OsNAC的转基因水稻相比,根特异RCc启动子驱动OsNAC的转基因水稻不仅根系更加庞大,而且对干旱的

10、耐受力也大大增强.由此可见,挖掘分离新型植物根系特异性启动子具有很强的应用前景和意义.本研究从水稻中筛选克隆得到Osg基因的启动子序列,转录水平分析发现其具有根系表达的特异性.Osg启动子驱动GUS报告基因的水稻转基因研究表明,GUS基因只在水稻根尖部位表达,且具有很强的特异性.利用该根尖特异表达启动子,我们对一个水稻短根突变体srg进行了根尖特异表达OsSRG基因回复功能分析.我们的研究结果表明,Osg启动子是一个新的水稻根尖特异表达启动子,可用于驱动目的基因在水稻根尖的特异性表达及功能分析.本研究结果将为通过基因工程方法进行水稻根系组织特异表达功能基因研究奠定基础.材料与方法材料水稻材料供

11、试水稻材料为粳稻品种(OryzasativaLsubspjaponica)日本晴以及srg短根突变体.菌株、载体及生化试剂大肠杆菌DH和农杆菌株EHA为本实验室保存.克隆载体pEASYBluntSimple购自北京全式金生物技术有限公司.PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.限制性内切酶和TDNA连接酶等购自NEB(北京)公司.高保真DNA聚合酶等购自TOYOBO公司.InFusionHDCloning系统等购自TaKaRa公司.cDNA第链合成系统等购自Invitrogen公司.实时SYBRGreenIMaster购自Roche公司.方法水稻DNA和RNA提取参照CTAB法从水稻叶片中

12、提取总DNA.分别取生长d水稻幼苗的根部和叶片以及水稻开始抽穗时约cm长的幼穗等组织.将水稻各组织样品用液氮充分研磨后,采用QIAGEN公司的RNeasyPlantMiniKit分别抽提各样品的总RNA.实时定量PCR取各RNA样品g,按Invitrogen公司提供的SuperScript第链合成系统合成第链cDNA.以该cDNA为模板,用Roche公司的LightCycler定量PCR仪进行荧光实时定量RTPCR分析.根据Osg基因的序列信息,设计跨内含子序列的相应特异性引物qF(ACAAGTCCGGCGACTCCT)和qR(TTCCGGTAGAAAGAGCTCCA)用于定量PCR.每一个P

13、CR设置次重复.反应体系按照SYBRGreenIMaster试剂盒(Roche公司)推荐的方法进行.定量PCR程序如下:下min,下s,下s,下s,个循环后添加PCR产物熔解曲线分析.选取水稻OsActin基因作为内参基因.通过RocheLCSW软件分析采集到Ct值后,输入EXCEL表格,采用Ct方法作数据分析.启动子的克隆与植物表达载体的构建按照水稻数据库网站(http:/riceplantbiologymsuedu/indexshtml)公布的Osg基因组序列,设计启动子特异引物proF(TGCTCTAGATTCAATTCTCTTTTAAGATTTA)和proR(CGCGGATCCCTCT

14、CGATCGATCGATCTATTA),划线处为引入的Xba和BamH的酶切位点.扩增产物连接到中间载体pEASYBluntSimple进行测序分析,将测序正确的质粒用Xba和BamH双酶切,然后将回收的目的片段插入pCAMBIA载体,获得pCAMBIAOsgProGUS融合载体.中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)本实验室在前期已构建了一个含有水稻OsSRG基因的pCAMBIASSRG表达载体,首先酶切去除SRG基因端的S启动子,根据线性化载体的末端序列设计InFusion引物,PCR扩增获得末端具有同源碱基序列的OsgProGUS(不含终止密码子)片段.利用InFusi

15、on系统将扩增片段与线性化表达载体进行同源重组,对重组质粒进行测序分析,获得pCAMBIAOsgProGUSSRG融合表达载体.水稻遗传转化选取成熟饱满的水稻种子脱壳后,经消毒滤干后接种到愈伤诱导培养基上进行诱导培养.选择外观颜色嫩黄、生长良好的颗粒状愈伤组织作为转化的受体材料.参照参考文献方法进行水稻愈伤组织的侵染转化.GUS组织化学染色按照Jefferson的方法进行GUS组织化学染色分析.将截取的合适大小的水稻新鲜组织浸泡在预先配制好的GUS染液里,保温一段时间直至样品变蓝,之后用乙醇脱色,用体视显微镜(LEICA公司)观察染色结果,拍照并记录.结果与分析Osg基因在不同组织中的转录水平

16、通过对水稻不同的基因表达谱芯片数据,的分析,挑选到个在水稻根系强烈表达的基因Osg.通过实时定量RTPCR的方法,对候选基因Osg在水稻不同组织器官中的表达量变化进行了验证(图).可以看出,Osg基因在水稻根中的表达量最高,在叶片、茎及幼穗组织中几乎检测不到表达量.上述结果显示该基因具有根系特异性表达特征.启动子的克隆及表达载体构建根据水稻Osg基因组启动子序列设计特异引物并进行PCR扩增,获得一段长约kb的DNA片段,测序结果表明该DNA片段与水稻数据库中公布的相应序列一致(图A).对启动子序列进行分析,发现有个根系特异表达相关元件ROOTMOTIFTAPOX(图B).将克隆于pEASYBl

17、unt载体上的Osg启动子片段亚克隆插入pCAMBIAGUS表达载体,形成水稻图Osg基因在水稻各组织中的表达FigExpressionofendogenousOsgtranscriptlevelindifferentricetissues转化载体pCAMBIAOsgProGUS(图C).启动子驱动GUS报告基因的表达特性pCAMBIAOsgProGUS载体通过水稻愈伤转化,获得日本晴转基因植株.利用Osg启动子上游引物和GUS报告基因下游引物,对转基因水稻植株进行分子检测,共获得株阳性苗.图显示部分转基因植株的PCR分析结果.分别选取株阳性转基因植株的不同组织进行GUS染色检测,其中个株系能

18、检测出GUS染色,且GUS染色模式基本一致.典型GUS染色结果如图所示.转基因日本晴的根尖检测到强烈的GUS基因表达活性,而在叶片、花以及根的成熟区部位都没有显示GUS活性.由此可以看出,Osg启动子驱动GUS基因仅在转基因水稻的根尖特异性表达.利用Osg启动子的基因功能分析为了探讨Osg启动子驱动下游目标基因特异性表达从而进行基因功能研究的可能性,我们将水稻中OsSRG基因与OsgProGUS片段融合.本实验室前期研究表明OsSRG基因的缺失突变造成水稻突变体srg的短根性状,而OsSRG基因在水稻中是组成型表达,为了分析该基因表达部位对水稻根系发育的影响,我们将构建的pCAMBIAOsgP

19、roGUSSRG载体(图D)转化水稻突变体srg.利用启动子上游引赵红玉等:一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定AOsg启动子扩增结果;B启动子序列中的根特异表达相关元件(方框示正向序列,星号示反向序列);COsg启动子GUS表达载体;DOsg启动子GUSSRG融合表达载体.A,CloningofOsgpromoterbyPCR;B,ROOTMOTIFTAPOXmotifinpromotersequence(boxindicatesforwardsequences,asteriskindicatesreversesequences);C,ConstructforOsgProGUSvecto

20、r;D,ConstructforOsgProGUSSRGvector图Osg基因启动子克隆及植物表达载体TDNA区FigCloningofOsgpromoterandstructureoftheTDNAregionofplantexpressionvectorsMDNALadder分子量标记;P载体质粒;N非转化对照植株;转基因植株.M,DNALadderMarker;P,Positivecontrolofplasmid;N,Negativecontrolofuntransformedplant;,Differenttransformedplants图转基因植株的PCR检测FigPCRanal

21、ysisoftransformedplants物和OsSRG基因下游引物进行分子检测,获得株阳性转化植株.为进一步检测OsSRG基因在Osg启动子驱动下的表达情况,分别从野生型、突变体及转基因材料的根和叶片中提取RNA进行半定量RTPCR检测.结果显示,OsSRG基因在野生型的根和叶片中均有表达,而突变体中检测不到该基因的表达.与我们预期一致,转基因突变体根部能检测到OsSRG基因的转录表达,不同株系间的表达量略有不同.而叶中与突变体一致,检测不到OsSRG基因的表达(图A).由于转化突变体的表达载体中GUS基因与OsSRG基因为同阅读框架融合,因此进一步对转基因突变体进行GUS染色检测能够追

22、踪OsSRG基因表达的组织位置.染色结果显示获得的个转基因突变体植株均能检出GUS活性,且该活性都只定位在根尖(图B).这些结果进一步表明,转基因突变体中OsSRG基因在Osg启动子驱动下能够在水稻根尖正常转中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)A主根;B长侧根;C短侧根;D叶片;E叶片横切面;F小穗.A,Primaryroot;B,Longlateralroot;C,Shortlateralroot;D,Leaf;E,Crosssectionofleaf;F,Spiklet图Osg启动子驱动GUS基因在日本晴不同组织中的表达FigExpressionofGUSgenedri

23、venbyOsgpromoterindifferenttissuesoftransformedNipponbareAOsSRG基因在转基因突变体根(R)和叶(L)中的表达.野生型;突变体;转基因突变体P;转基因突变体P.B转基因突变体根中的GUS活性染色.A,ExpressionofOsSRGtranscriptlevelinroot(R)andleaf(L)oftransformedsrgmutants,Wildtype;,srgmutant;,TransformedsrgP;,TransformedsrgPB,GUSactivityinrootoftransformedsrgmutants

24、图Osg启动子驱动的OsSRG基因在水稻突变体srg中的表达FigExpressionofOsSRGdrivenbyOsgpromoterintransformedsrgmutants赵红玉等:一个新水稻根尖特异表达启动子的分离与鉴定AOsSRG基因的转基因突变体;B转基因突变体和对照的根系长度(每个株系的数据为个单株的平均值).WT野生型.A,OsSRGtransformedmutants;B,Rootlengthoftransformedmutantsandnontransformedplants(Eachvaluerepresentsthemeanofdatafromindividual

25、s)WT,Wildtype图Osg启动子驱动OsSRG表达回复水稻突变体srg的短根性状FigCharacterizationofsrgplantscomplementedwithOsSRGdrivenbyOsgpromoter录表达.选取个阳性转基因突变体株系的T代抗性苗,与野生型日本晴和突变体srg在水稻营养液中培养d.生长结果显示转基因株系的根系长度相较突变体均有显著的增长(图A).与突变体srg对照相比,转基因株系的根长分别增加了倍和倍,根系长度接近于野生型对照(图B).表明OsSRG基因在水稻根尖的表达能维持水稻根系伸长,Osg启动子能用于未知基因在水稻根尖的功能分析.讨论根系是植物

26、重要的营养器官,利用根系的特异启动子来驱动目标基因在植物根部的表达,能够促进植物对水分养分的吸收和提高植物对环境胁迫的耐受力,.本研究对Osg基因启动子在水稻中的表达特性进行了研究.通过对基因上游kb启动子的研究发现,该启动子片段具有驱动GUS报告基因在水稻根尖中特异性表达的特征.这与水稻內源Osg基因表达分析的实时定量RTPCR结果是一致的.利用PLACE软件对Osg基因启动子序列进行顺式作用元件的预测分析,除了多个能增强转录效率的CAAT盒、GATA盒,发现个与根系特异表达密切相关的ROOTMOTIFTAPOX元件.从分布位置来看,其中个根系相关元件集中于启动子序列端,个位于起始密码子上游

27、bp内.此外,该启动子中也发现一些地上部表达相关元件,例如叶肉特异表达CACTFTPPCA元件和花粉特异表达GTGANTG元件.与根系特异表达ROOTMOTIFTAPOX元件相比,这些地上部表达的相关元件在数量与分布位置上各有不同.根据Osg启动子在水稻根尖的特异性表达结果,推测在该启动子区域内有可能还存在一些抑制或阻遏基因在地上部组织表达的未知顺式作用元件.在这些不同功能的顺式作用元件共同作用下,Osg启动子表现出特异的根尖表达特征.对于这些分布在不同位置的根系特异表达元件,我们将通过一系列启动子截短的活性分析,进一步明确维持根尖表达特异性的重要元件.植物根系分生区位于根尖,能为植物根系提供

28、源源不断的新细胞,最终影响植物根系长度.而根系分生区活力受到很多因素及基因效应的影响,如地上部生长素的合成及其向根尖分生区的运输、根尖分生区的细胞分裂能力等.要明确特定根系发育基因对根系发育影响的可能机制,一个重要的方面是明确基因作用的具体效应位置.利用Osg启动子驱动OsSRG基因在水稻根尖特异表达的研究发现,转基因突变体srg能够很好地回复其短根突变性状.表明OsSRG在根尖的特异表达能够维持水稻根系的正常生长,而其地上部的表达与根系发育无关.总之,我们的研究结果表明,作为水稻自身来源的启动子,根尖特异表达的Osg启动子具有良好的应用前景,不仅可用于控制目的基因在根尖中的特异表达,还能用于

29、根系功能基因效应位置分析.参考文献:OdellJT,NagyF,ChuaNHIdentificationofDNAsequencesrequiredforactivityofthecauliflowermosaicvirusSpromoterNature,():KimSR,KimY,AnGIdentificationofmethyljasmonateandsalicylicacidresponseelementsfromthenopalinesynthase(nos)promoterPlantPhysiol,():ChristensenAH,QuailPHUbiquitinpromoterba

30、sedvec中国水稻科学(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)torsforhighlevelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplantsTransgenicRes,():ChristensenAH,SharrockRA,QuailPHMaizepolyubiquitingenes:Structure,thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertopro

31、toplastsbyelectroporationPlantMolBiol,():McElroyD,BlowersAD,JenesB,etalConstructionofexpressionvectorsbasedonthericeactin(Act)regionforuseinmonocottransformationMolGenGenet,():JangIC,ChoiWB,LeeKH,etalHighlevelandubiquitousexpressionofthericecytochromecgeneOsCcanditspromoteractivityintransgenicplants

32、providesausefulpromoterfortransgenesisofmonocotsPlantPhysiol,():JeonJS,LeeS,JungKH,etalTissuepreferentialexpressionofaricealphatubulingene,OsTubA,mediatedbythefirstintronPlantPhysiol,():WangJ,OardJHRiceubiquitinpromoters:DeletionanalysisandpotentialusefulnessinplanttransformationsystemsPlantCellRep,

33、():HsiehTH,LeeJT,CharngYY,etaTomatoplantsectopicallyexpressingArabidopsisCBFshowenhancedresistancetowaterdeficitstressPlantPhysiol,():PinoMT,SkinnerJS,ParkEJ,etalUseofastressinduciblepromotertodriveectopicAtCBFexpressionimprovespotatofreezingtolerancewhileminimizingnegativeeffectsontuberyieldPlantBi

34、otechnolJ,():PotenzaC,AlemanL,SenguptaGopalanCTargetingtransgeneexpressioninresearch,agricultural,andenvironmentalapplications:PromotersusedinplanttransformationInVitroCellDevBiol,():郝中娜,王海华,郭泽建水稻OsWRKY基因启动子的表达特性中国水稻科学,():TaniguchiM,IzawaK,KuMS,etaThepromoterforthemaizeCpyruvate,orthophosphatedikina

35、segenedirectscellandtissuespecifictranscriptionintransgenicmaizeplantsPlantCellPhysiol,():李钱峰,张桂云,于恒秀,等水稻异淀粉酶基因ISA及其启动子的表达特性分析中国水稻科学,():马沁沁,张金辉,陈荣军,等水稻花药绒毡层特异表达启动子的分离与表达载体构建应用环境生物学报,():武丽敏,陈维,赵艳,等乔松根特异启动子PmPgPR驱动Na/H逆转运蛋白提高转基因水稻的耐盐性中国水稻科学,():房孝良,刘炜,安静,等水稻种胚特异性启动子OsESP的克隆及其表达特性作物学报,():ConklingMA,Chen

36、gCL,YamamotoYT,etalIsolationoftranscriptionallyregulatedrootspecificgenesfromtobaccoPlantPhysiol,():WernerT,NehnevajovaE,KllmerI,etalRootspecificreductionofcytokinincausesenhancedrootgrowth,droughttolerance,andleafmineralenrichmentinArabidopsisandtobaccoPlantCell,():JeongJS,KimYS,BaekKH,etalRootspec

37、ificexpressionofOsNACimprovesdroughttoleranceandgrainyieldinriceunderfielddroughtconditionsPlantPhysiol,():MurrayMG,ThompsonWFRapidisolationofhighmolecularweightplantDNANucleicAcidsRes,():ChenSY,JinWZ,WangMY,etalDistributionandcharacterizationofoverTDNAtagsinricegenomePlantJ,():JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMWGUSfusions:BetaglucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplantsEMBOJ,():HruzT,LauleO,SzaboG,etalGenevestigatorV:AreferenceexpressiondatabaseforthemetaanalysisoftranscriptomesAdvBioinform,:WangL,XieW,ChenY,etalAdynamicge