12蛋白质结构测定和分析

1、第,10,讲,蛋白质结构测定和分,析,生物信息学,Why protein structures,仅仅限于药物研发吗,各种蛋白质原子结构,解释了生命的本质,细胞维持基本生命特征,适应内外环境,进化选择了一套精巧的分子机制,细胞是生命的基本单位,细胞内几乎每个生物学过程,均包含多个蛋白质相互作用,细胞：精巧的“生化工厂,蛋白质相互作用,细胞器,蛋白质,蛋白质组,基因,基因组,组织,器官,及以上层次,细胞,认识,蛋白质机器,及其相互作用模式,是破译生命规律不,可或缺的重要层次,功能,OK,结构,功能,结构,传统的做法,现代的做法,蛋白质结构测定与功能研究同步进行、甚至先行一步,并非一定在清楚功能的前

2、提下再开展三维结构研究,生物大分子三维结构研究方法,核磁共振波谱学,X,射线晶体学,低温电镜技术,测定生物大分子结构重要手段,具有不同结构特征的原子核间距、肽键二面角、肽键的动态特性等都具,有特征的核磁共振谱线,1,H,13,C,15,N,是核磁共振检测的主要对象,各有不同的共振频率,从而形成核,磁共振氢谱、碳谱和氮谱三部分,NMR,不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法,核磁共振谱仪的组成,Magnet,Probe,Console,Computer,1985,年,维特里希,Kurt W,thrich,等人公布了第一次利用,NMR,法,测定的溶液中蛋白质,蛋白酶抑制剂,IIA ( pro

3、teinase inhibitor IIA,的,结构,目前,科学家已经利用这一方法绘制出,15 ,20 ,的已知蛋白质的结构,它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,直接,在溶液中,测定自然状态下的大分子三维空间,结构，其分辨率已接近,0.12nm,它,只能测量分子量较小,15-25kDa,的生物分子,最大可测定,35kDa,的生物分子,NMR,测定结构的特点,Bioinformatics,Protein Crystal,SR X-ray source,hkl,xyz,Tracing ,Building,Final Structural Model,Initial Struc

4、tural Model,Structural,Refinement,Raw genomic data,F,hkl,Diffraction Data,Technical Roadmap from gene to protein by SR X-ray crystallography,Computer control Chapter 17:Unit 17.2,负染技术,低温透射电子显微镜技术,Curr,Protoc,Protein Sci. 2005 Dec;Chapter,17:Unit 17.2,Physiology,21: 13-18, 2006,速冻技术,优点,将样品保留在液相中,维持了天

5、然结构,高分辨率,揭示内部结构,不足,设备及操作要求较高,信噪比低,生物样品为什么需要低温,脂质体负染图,脂质体冷冻电镜图,为什么需要低温：冷冻超薄切片举例,为什么需要低温：冷冻负染举例,低温样品制备,VITROBOT,VITRIFICATION ROBOT,Incubation of suspension on grid (holey,carbon or Quantifoils) at constant temperature,and humidity,Automated blotting,Plunge freezing in liquid cryogen (ethane,propane,I

6、nvestigation in amorphous ice,C-film,Suspension with macromolecules,Cryo-holder workstation,低温样品转,移,过程,低于,170,C,Cryo-holder,workstation,低温样品杆,From Lake (1972), p.174,In theory,In practice,Cryo-EM,3D,Reconstruction,of Viruses,提纯样品,图像整合,Localization and,EPU,Xplore3D,断层图像重构,单颗粒重构,Argos,低温电镜三维结构重建,速冻样品制

7、备,样品预扫描,负染,低温电镜,超微图像采集,In electron microscope,2D images,In our program,3D map in computer,3D virus in real world,compute 3D maps from 2D images,Icosahedral Particle Image Reconstruction Scheme,Icosahedral Virus 3D Reconstruction Scheme,Digitize Micrograph,Select Images,Compute 3DR,Monitor Data Quali

8、ty,Done,Establish Refinement Criteria,Resolution Limits,Box Particles,Refine,N,N,More,Data,E,x,p,a,n,d,D,a,t,a,S,e,t,Y,Resample,Rebox,N,Pre-Process Images,Archive Data,Visualize & Interpret 3D Structure,Y,Determine Origin and,Orientation,q,f,w,x,y,R,e,f,i,n,e,m,e,n,t,Y,Refine CTF,Initial,3D Model,Au

9、to3dem,Digitize Micrograph,HPV58,VLP,低温电镜结构重建,Box Particles,1400,micrographs,6000 particles,Pre-Process Images,Remove blemish, Remove Gradient,Normalize means/variances, Apodize,Determine CTF parameters,Create Initial Parameter Files,HPV58,VLP,低温电镜结构重建,Specifying,Direction,of View,q,f,w,Orientation,

10、q,f,5,5,3,Z,X,Y,80,-15,w,asymetric,unit,of,HPV,VLP,5,parameters to describe a boxed particle,3 rotational angles,q, f,and,w,in degrees,2 translational parameters,x, y,in pixels,Determine Origin and,Orientation,q,f,w,x,y,x,y,Compute 3D map,Automation auto3dem,Goal: combine,good,HPV58 particle,images

11、to compute a 3D density,map,HPV58,VLP,低温电镜结构重建,Initial,3D Model,结构与功能示例,RIG-1,RIG-1,RIG-1(retinoic acid-inducible,gene 1,一种,dsRNA,解旋酶,细胞浆内识别病毒,RNA,的感受,器,receptor,，特异识别外源,5,ppp RNA,RIG-1,是,NF-kB,信号通路的重,要调控因子与抗病毒免疫反应,病毒感染引起的自身免疫有关,Structure.2010, 18:894,Downstream,Signal,Inactive,active,Mol Cell 2008, 29:169,结构与功能示例,RSV,RSV,呼吸道合胞病毒,RSV,respiratory syncytial virus,pneumonia,是在婴儿时,期和儿童早期导致支气管,炎和肺炎的主要原因,融合蛋白,Fusion protein,F,蛋白）介导病毒入胞的第,一步,F,蛋白与细胞膜融合前后的,空间结构不同，融合前,F,蛋,白,pre-fusion,可作为,RSV,感染预防新靶标,Pre-fusion protein,复合物的空间结构,Pre-fusion pro