2017 2018高中生物第四章生物化学与分子生物学技术实践第10课时分子生物学技术同步备课苏教选修11

1、第,10,课时,分子生物学技术,章,生物化学与分子生物学技术实践,学习导航,1,结合教材了解,PCR,技术的基本操作,2,理解,PCR,扩增,DNA,片段的原理,3,结合教材，尝试进行目的,DNA,片段的体外扩增,重难点击,1,了解,PCR,技术的基本操作,2,理解,PCR,的原理,一、使用,PCR,仪的安全措施和,PCR,反应程序,二、目的,DNA,片段的体外扩增与鉴定,内容索引,当堂检测,一、使用,PCR,仪的安全措施和,PCR,反应程序,1.DNA,分子的结构,1,写出各个标号的名称,基础梳理,胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,脱氧核糖,磷酸基团,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,氢键,碱基对,一条脱

2、氧核苷酸链,2)DNA,的两条链是反向平行的,为了明确表示,DNA,链的方向,通常将,DNA,的羟基末端称为,3,端，将磷酸基团的末端称为,5,端，按此原则在图上方框内标出,两条链的方向,答案,左链上,5,端，下,3,端,右链上,3,端，下,5,端,答案,2,细胞内,DNA,复制条件分析,条件,组分,作用,模板,DNA,的,条,单链,提供复制的模板,原料,四种,_,合成,DNA,子链的原料,酶,解旋酶,打开,_,两,脱氧核苷酸,DNA,双螺旋,合成,DNA,子链,ATP,3,端,3.PCR,技术,1,概念：在,快速扩增,的技术,称为,PCR,技术,2,物质条件,3)PCR,反应的过程及结果,P

3、CR,反应程序,a,在,94,高温下，作为模板的,解旋成为,b,反应体系的温度降至,引物与作为模板的单链,DNA,上的,相互配对,体外,特定基因或,DNA,序列,目的,DNA,片段,DNA,模板,四种脱氧核苷酸,Taq,DNA,聚合酶,引物,变性,双链,DNA,单链,DNA,退火,复性,55,特定部位,c,反应体系的温度回升到,按照单链,DNA,上的脱氧,核苷酸序列,4,种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则，在,Taq,DNA,聚合,酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的,结果,a.PCR,扩增一般要经历三十多次循环，每次循环都包括,_,三步,b,两引物之间的固定长度的,DNA,序列呈

4、,扩增,延伸,72,左右,DNA,双链,变性、退火,延伸,指数,问题探究,1.PCR,原理,PCR,反应与体内,DNA,复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因,答案,不相同。体内,DNA,复制所需引物为,RNA,聚合酶合成的一小段,RNA,但,PCR,反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链,DNA,答案,2.PCR,反应过程,1)PCR,反应中需要解旋酶和,DNA,聚合酶吗？若需要，则与细胞内,DNA,复制有何区别,答案,PCR,反应不需要解旋酶，但需要,DNA,聚合酶。由于,PCR,反应中需,要高温使,DNA,解旋，因此,PCR,所需的,DNA,聚合酶能耐高温,2)PCR,的每次循环中

5、应如何控制温度？请分析原因,答案,每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升,温有利于,Taq,DNA,聚合酶发挥作用,答案,3,结合下图分析,PCR,过程中,DNA,复制的方向是怎样的,答案,PCR,扩增与,DNA,复制的异同,归纳总结,项目,DNA,复制,PCR,扩增,不,同,点,时期,有丝分裂间期或减数第一次,分裂的间期,任何时期,场所,活细胞内,细胞外,酶,解旋酶,DNA,聚合酶,耐高温的,Taq,DNA,聚合酶,引物,有转录，产生,RNA,作引物,无需人工加入,无转录，无引物产生，需人工加,入两种,DNA,引物,特点,边解旋边复制,先全部解旋后开始复制,缓冲液,不需缓冲

6、液,配制缓冲液代替细胞核液,设备,无,控制温度变化的温控设备,相,同,点,原理,严格遵循碱基互补配对原则,引物,都需要分别与两条模板链相结合的两种引,物,模板,DNA,的两条链为模板,特点,半保留复制,原料,游离的四种脱氧核苷酸,解析,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,故,DNA,复制需要引物,DNA,聚合酶只能从,3,端延伸,DNA,链，而不能从,5,端延伸,DNA,链,引物通过碱基互补配对原则与,DNA,母链相结合,PCR,扩增的对象是,DNA,不是氨基酸序列,拓展应用,1,下列关于,DNA,复制和,PCR,技术的描述中，正确的是,A.DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,只能从,

7、5,端延伸,DNA,链,B.DNA,复制不需要引物,C,引物与,DNA,母链通过碱基互补配对进行结合,D.PCR,扩增的对象是氨基酸序列,答案,解析,解析,PCR,技术中用高温使,DNA,分子中的氢键打开，从而解旋，其原理,是,DNA,的热变性原理,2.PCR,技术有效地解决了因为样品中,DNA,含量太低难以对样品进行研究,的问题，而被广泛应用，与细胞内的,DNA,复制相比,PCR,可以快速扩增,所需的,DNA,片段，请分析回答下列有关问题,1,体内,DNA,复制过程中用解旋酶打开双链,DNA,而,PCR,技术中的解旋,原理是,答案,解析,DNA,的热变性原理,2,此过程需要一种,Taq,DN

8、A,聚合酶。该酶是从,中分离的,解析,Taq,DNA,聚合酶是从水生耐热细菌,Taq,中提取的,3,与普通,DNA,聚合酶相比,Taq,DNA,聚合酶具有的特性是,解析,与普通,DNA,聚合酶相比,Taq,DNA,聚合酶在,90,以上的环境中不,变性，具有耐高温的特性,4,与体内,DNA,复制相比较,PCR,反应要在,中才能进行,并且要严格控制,条件,解析,PCR,反应需要适宜的温度和,pH,因此,PCR,反应要在一定的缓冲溶,液中进行，并需严格控制好温度条件,答案,解析,水生耐热细菌,Taq,耐高温,一定的缓冲溶液,温度,5)PCR,中加入的引物有,种，加入引物的作用是,解析,PCR,需要两

9、种引物，引物的识别位点决定了,PCR,扩增的,DNA,片,段,PCR,中加入的引物一般是一小段单链,DNA,作用是引导,DNA,复制,可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为,DNA,复制的,起点,答案,解析,2,作为,DNA,复制的起点,细胞内的,DNA,复制需要适宜的温度和,pH,吗？若需要，是如何实现的,答案,需要。细胞内的适宜温度和,pH,与内环境的稳态有关，低等生物,与环境因素有关,答案,一题多变,与,PCR,原理有关的三个易错点,1,酶的作用位点：解旋酶的作用是使,DNA,两条链之间的氢键断开,DNA,聚合酶与,DNA,连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋,

10、酶也作用于磷酸二酯键,2)DNA,聚合酶和,DNA,连接酶,DNA,聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的,单链片段的,3,端上，需要模板；而,DNA,连接酶连接的是两条,DNA,片段的,缺口，不需要模板,3)PCR,中的解旋过程,PCR,过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开,氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此,DNA,加热变性后变为,单链，并未分解成单体,易错提醒,二、目的,DNA,片段的体外扩增与鉴定,基础梳理,1.DNA,片段的,PCR,扩增,1,准备器材,PCR,仪、台式高速离心机,0.2,mL,PCR,微量离心管、自动取,液器、模板,DNA,等,2,在,0.2 mL PCR,微

11、量离心管中加入,缓冲液,_,的溶液各,5,L,模板,DNA,引物,1,和,5,L,引物,2,双蒸水,3,煮沸,之后冰浴,低速离心，按照,1,单位,L,加,入,4,扩增,DNA,片段的反应程序：将微量离心管放入,PCR,仪中，盖上样品池盖,在,的条件下预热,5 min,再设置反应程序为,_,5 L 10,倍浓缩的,PCR,4,种脱氧,核苷酸,1 L,5 L,29 L,5 min,2 min,Taq,DNA,聚合酶,94,94,30 s,55,30 s,72,1 min,72,1 min,2.DNA,分子的测定,1,配制二苯胺试剂：分别配制,A,液,1.5 g,二苯胺溶于,100 mL,中，再,加

12、入,1.5 mL,浓硫酸，用棕色瓶保存,和,B,液,体积分数为,0.2,的,溶液,将,0.1 mL B,液加入,10 mL A,液中，混匀,2,条件：取一定量扩增前和扩增后的溶液分别放入等量的二苯胺试剂,混匀后观察颜色变化。用,加热上述溶液,3,现象：出现,现象,3,定量分析方法,如果需要进行定量分析,可以采用,或,_,前者需要使用,后者需要使用,等,冰醋酸,乙醛,沸水浴,蓝色,紫外分光光度法,琼脂,糖凝胶电泳法,紫外分光光度计,电泳仪,问题探究,1,实验过程分析,1,离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定,要盖严,答案,离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率

13、。微量,离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢,2,在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么,答案,离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀,答案,3)PCR,实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使,用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目,的相同,答案,为避免外源,DNA,等的污染。在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换,答案,2,结果检测,1,实验中为什么要测定,DNA,的含量,答案,实际操作过程中会有许多因素影响,DNA,含量，所以需要对,DNA,含,量进行测定,2,如何判断,DNA,扩增成功,答案

14、,可以通过计算,DNA,含量来评价扩增的效果,电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察,DNA,带的分布及粗细,程度来评价扩增的效果,3)PCR,扩增过程可能会出现哪些异常结果,答案,样品产物少，或产生新的,DNA,答案,拓展应用,3,进行,PCR,反应的具体实验操作顺序应为,设计好,PCR,仪的循环程序,按配方准备好各组分,用微量移液器,向微量离心管中依次加入各组分,进行,PCR,反应,离心使反应液集,中在离心管底部,A,B,C,D,答案,解析,解析,PCR,反应的操作步骤一般分为准备,包括配制配方及将各配方放于,实验台上,移液,混合,离心,反应,PCR,仪是一种自动控制,温度的仪器，设计

15、好循环程序就可以进行反应了,4,近,20,年来,PCR,技术,多聚酶链式反应,成为分子生物学实验室的一种常规,实验手段，其原理是利用,DNA,半保留复制，在试管中进行,DNA,的人工复制,如图,在短时间内，将,DNA,扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室,所需要的遗传物质不再受限于活的生物体,1,加热使,DNA,双链间的,键完全打开，称为,而在细胞中是在,酶的作用下进行的,答案,解析,氢,解旋,解旋,解析,PCR,技术利用热变性原理使,DNA,双链之间的氢键断裂，称为解旋,而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂,答案,解析,2,如果只需要大量克隆模板,DNA,中间的某个特定区段，应该加入,种

16、特,定的引物。当温度降低至,55,时，引物与两条,舒展,的模板链的特定位,置结合，在,DNA,聚合酶的作用下，只能在引物的,端连接脱氧核苷酸,两条子链的延伸方向都是,两,3,从子链的,5,端向,3,端延伸,解析,PCR,技术与细胞内的,DNA,复制不完全相同，除了需要模板、原料,酶以外，至少还需要液体环境,稳定的缓冲溶液,每一个步骤都需要适宜,的温度和酸碱度等,答案,解析,3)PCR,技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件,即液体环境、适宜的,和,前者由,自动调控，后者则靠,来维持,温度,酸碱度,PCR,仪,缓冲液,解析,一个,DNA,分子连续复制四次之后，形成,16,个,D

17、NA,分子,15,N,标记的,DNA,分子有,2,个，则,15,N,标记的,DNA,分子占全部,DNA,分子总数的比例为,1/8,答案,解析,4,通过,PCR,技术使,DNA,分子大量复制，如果将一个用,15,N,标记的,DNA,分子,放入试管中，以,14,N,标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则,15,N,标记的,DNA,分子占全部,DNA,分子总数的比例是,1/8,问题导析,课堂小结,放入,PCR,仪扩增,引物,复性,当堂检测,1.PCR,利用了,DNA,的哪种特性来控制,DNA,的解聚与结合,A,特异性,B,稳定性,C,热变性,D,多样性,2,3,4,5,1,答案,2,符合,PC

18、R,反应条件的一项是,稳定的缓冲液环境,DNA,模板,合成引物,四种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,DNA,解旋酶,限制酶,温控设备,A,B,C,D,答案,解析,2,3,4,1,5,解析,PCR,反应模拟了生物细胞内,DNA,复制的条件，只是无需解旋酶,可热变性,也不需要基因工程的工具酶,限制酶,解析,PCR,是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术，在高温条件下，把,DNA,的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的,DNA,聚合,酶，同时，还需要引物，从引物的,3,端连接脱氧核苷酸,3,下列关于,PCR,的描述中，正确的是,PCR,是一种酶促反应,引物决定了扩增的特异性,扩增,DNA,利,用了热变性的原理,扩增的对象是氨基酸序列,A,B,C,D,答案,2,3,4,1,5,解析,4,如图所示为,PCR,扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物,A,第一次循环,B,第二次循环,C,第三次循环,D,第四次循环,解析,2,3,4,1,答案,5,5,多聚酶链式反应,PCR,是一种体外迅速扩增,DNA