ELISA基础知识和注意事项

1、26.01.2021,elisa基础知识和注意事项,26.01.2021,类容,elisa的基本原理和相关概念 特别说说捕获法 elisa结果的影响因素 elisa结果的处理,26.01.2021,elisa的基本原理和相关概念,将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或 抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性,26.01.2021,elisa的基本原理,抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合,26.01.2021,抗原抗体

2、复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析,26.01.2021,elisa的分类,测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗体夹心法。 测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法,26.01.2021,竞争法elisa,竞争法elisa原理标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色越浅。 要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定,26.01.2021,26.01.2021,双抗体夹心法,双抗体夹心法elisa 将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗

3、原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。 检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇,26.01.2021,包被特异性抗体,26.01.2021,双抗原夹心法,双抗原夹心法elisa检测标本中的总抗体（包括igm和igg型抗体） 。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性igm和igg型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色,26.01.2021,26.01.2021,间接法,间接法 elisa（indirect elisa）将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人igg或igm抗体与之结

4、合，洗涤后加入底物显色。 酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子 只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体,26.01.2021,26.01.2021,捕获法,elisa（capture elisa）专门用来检测igm型抗体的方法。将抗人igm抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人igm抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性igm抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色,26.01.2021,26.01.2021,区别理解,检测抗原？抗体？ 包被什么？ 标记什么,26.01.2021,间接法和捕获法比较,间接法：假阴性，假阳性 捕获法：酶标抗

5、体的要求较高,26.01.2021,间接法的假阳性,26.01.2021,间接法的假阴性,麻疹igg,麻疹 抗原,麻疹igm,酶标抗人 igm抗体,阳性结果,假阴性结果,26.01.2021,elisa的有关名词概念,质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取cu

6、toff值2-3倍的质控品,26.01.2021,室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。 室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为 “各个实验室的质量评比,26.01.2021,临界值（cutoff值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。 本底：就是底色。如elisa hbsag，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。elisa 抗hbcab，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况,26.01.2021

7、,灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。 相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100% 测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率,26.01.2021,特异性： 真阴性标本的检出能力。 相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100% 测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率,26.01.2021,elisa结果的影响因素,试剂盒的选择 标本 加样与稀释 温育 洗版 显色 质控,26.01.2021,试剂盒的选择,同行的试剂使用情况 上级部门对试剂实际使用的综合评价 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选择林敏

8、度和准确度高、特异性强试剂盒,26.01.2021,标本,应注意避免溶血 在5 天内测定的血清标本可放置于4、超过一周测定的需20保存 尽量避免反复冻融（少量分装,26.01.2021,加样和稀释,加样本的准确性（个人因素和实验条件） 尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪，避免直接使用滴瓶） 各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说明是操作,26.01.2021,温育,温度 水浴箱 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板,26.01.2021,洗版,手洗 洗板机 （微孔液体残留45s,26.01.2021,显色,通常是a、b两种液体，不稳定，又颜色应立即丢弃 先加a后加b，显色时间严格按说明书进行 终止后15内比色,26.01.2021,质控,室内质控血清 即刻法,26.01.2021,elisa试剂的常见问题原因及其解决,显色浅，灵敏度低 假阳性多，本底高甚至花板 重复性不好 白板,26.01.2021,显色浅 灵敏度低,26.01.2021,26.01.2021,假阳性多，本底高甚至花板,26.01.2021,26.01.2021,重复性不好,26.01.2021,白板,26.01.2021,结果处理,od值出现负值 阴性对照