从基因工程视角探析植物耐热能力的提高

1、从基因工程视角探析植物耐热能力的提高1 植物耐热性的研究背景植物在生长发育过程中会受到各种非生物胁迫的影响，其中温度对植物生长发育的影响尤其严重.由于气候改变地球的平均温度正在上升，这意味着在很长一段时期内位于不同地域的植物将遭受高温胁迫的担忧会变为现实（Grover et al., 2013）。高温是植物经常遭受的主要环境胁迫之一，会影响植物的各种生理生化过程，如抑制光合作用、改变细胞膜稳定性、改变激素和次级代谢物的合成、引起氧化胁迫，使活性氧对膜系统造成损伤从而伤害植物，甚至导致植物死亡（邓朝军等， 2012）；同时高温也是限制农作物产量的一个重要因素，由于大多数植物的某些生长时期对高温较

2、敏感，所以在开花期等特殊时期的高温会引起粮食作物产量下降.尽管事实上植物具有自身进化和应对温度波动的能力，例如当温度高于环境温度 510时，植物就会产生热激反应（Heat shock response），在数小时内迅速获得耐热性，以抵御致死高温（鞠冠华等， 2012），但是植物的适应能力却远远敌不过全球变暖的速度。因此培育耐热性植物至关重要.让农作物在温室中生长的技术解决方案并不是最经济可行的选择。利用常规育种方法繁育耐高温等抵抗非生物胁迫的植株并不十分成功.原因很多，主要有：（1）耐非生物胁迫是由多基因控制，并且运用传统育种方法获得复杂性状是比较困难的；（2）抗性有关的重要基因在相兼容品种间

3、既不已知也不可用（Grover et al., 2013）。由于传统育种在植物提高耐热性上没有突破性的进展，从基因水平上提高植物的耐热能力成为一种新的研究趋势。在 20 世纪 90 年代初，就已经有研究利用基因改造的方法解决环境胁迫对于生物的影响，Murata （1983）将拟南芥或葫芦的脱氢酶基因在番茄中过表达实现了番茄耐低温.近年来，有很多关于利用转基因方法实现耐环境胁迫的研究，关于通过转基因方法来提高植物耐热性的研究也屡见不鲜.例如过量表达转录因子OsbZIP60提高了水稻的耐热性和耐旱性（喻旭等, 2011）;转基因苜蓿在启动子rd29A （水胁迫诱导的启动子）的控制下，通过过表达酵母

4、菌TPS1-TPP2基因改善植物生长、生物量和高温耐受性（Suárez et al., 2009）；转基因西红柿过表达单去氢抗坏血酸还原酶能够增强其对高温胁迫和氧化应激的耐受性（Li et al., 2010）；转基因拟南芥过表达 OsDREB2B 可增强目标基因 DRE-B2A 的表达，并能提高拟南芥耐热性（Matsukura etal., 2010）等，这都证明转基因技术在减缓环境胁迫伤害的方面具有明显的优势.2 提高植物耐热能力的途径目前，提高植物耐热性主要是利用操控热激应答（heat shock response, HSR）元件解决植物耐热。提高植物耐热能力的其分子机制是

5、：基因工程方法直接调节 Hsp 的表达水平；调节细胞渗透性；利用细胞解毒机制和改变细胞膜流动性（Grover et al., 1998;Burke and Chen, 2006）。这也是当前转基因植物提高耐热性的四个基本途径。2.1改变热激蛋白来提高植物耐热能力当植物处于比环境温度高 510时，植物就会产生热激应答.在高温胁迫环境中，植物的细胞代谢和生理代谢都会具有特征性.通过植物自身的特征反应，植物表现出耐热抗性.Ritossa （1962）早在1962 年第一次揭示了热激应答的分子原理。从 20 世纪80 年代开始，有研究人员就已经指出在植物的热激反应，植物关闭了自身蛋白合成的基因，开启了

6、特异的基因，这些基因合成了新的蛋白，这些新的蛋白赋予植物耐热性，被称为热激蛋白（heat shock protein,Hsp）,随后研究人员在几乎所有的生物中都发现了热激蛋白（Barnett et al., 1980）。拟南芥、玉米、番茄、水稻和小麦中都证明了热激蛋白的存在。根据热激蛋白的分子量把分为高分子量和低分子量两大类。这些热激蛋白的表达量也是不固定的，随着环境的变化而变化。在胁迫条件下小热激蛋白含量可以达到细胞总蛋白的 1% （Agarw-al et al., 2003）。在过去的 30 年里，研究人员对热激蛋白进行了深入的研究，包括生理、生化和细胞与分子特性（Vierling, 19

7、91; Agarwal et al., 2001; 2003; Kati-yar-Agarwal et al., 2001; Scharf et al., 2001）。热激蛋白在不同的物种之间有高度保守（Katiyar-Agarwal et al.,2001）。为了研究热激蛋白的详细特性，Wang等（2004）和Kotak等（2007）对热激蛋白的的几个重要方面：（a）分子质量；（b）诱导物；（c）蛋白的表达位置；（d）表达模式；（e）在野生条件下的合成；（f）细胞水平；（g）对保守的氨基酸序列等进行了深入的研究.研究结果表明，植物除了在热激条件下表达HSPs外，重金属、水胁迫、高盐浓度、损伤

8、、寒冷、缺氧等胁迫都会引起植物表达热激蛋白。有研究证明，植物在热处理后或具有热顺应性，会比没经过处理的植株更耐热，这种现象被叫做获得性耐热（Senthil-Kumar et al.2007）。耐热和获得性耐热都是以热激蛋白作为热胁迫的保护蛋白.近年来，分离、测序和克隆了大量的热激蛋白基因（Agar-wal et al.2003）。从大量不同物种中获得热激蛋白基因增加了热激蛋白的多样性，增加了热激蛋白的多样分类类型。对拟南芥和水稻的基因组测序信息进行生物信息学分析发现有大量的不同的HSP 基因家族信息（Krishna and Gloor, 2001）。热激蛋白在调节植物耐热功能控制方面有着重要的

9、作用.一些研究人员通过调节热激蛋白在微生物中的表达水平，证明小热激蛋白同样具有耐热功能，本文选取三个有针对性的研究结果来对其进行阐述.Yeh 等（2002）通过在微生物中过表达水稻中的Oshsp16.9使得转化后的大肠杆菌具有耐热性.为了确定Oshsp16.9功能结构的位置，研究人员在大肠杆菌中构建了小热激蛋白的缺失突变体，同时对其过表达.研究中发现，缺失了氮端 30 到 36 个残基或者保守结构的突变体，Oshsp16.9失去分子伴侣的活性，同时，大肠杆菌也不再耐受 47.5。在热激条件下渐渐的改变Oshsp16.9蛋白突变体证明氮端 30 到 36 个残基或者保守结构的 73 到 78 对

10、 Oshsp16.9 起着稳定性的作用，并且该保守结构和未折叠的蛋白如柠檬酸钠酶相互作用（Yeh et al., 2002）。GST-N74E73K和GST-N74E74K 两个 Oshsp16.9 的突变体表明 73 和74 是底物的重要结合位点（Yeh et al., 2002）。Yeh 等（1997）为了研究其耐热能力利用 pGEX-2T 表达载体将Oshsp16.9导入到E. coli给予环境胁迫，在 47.5下，E. coli XL1-bluecells 由于重组质粒含有通过人工修饰的载体转化有谷胱甘肽 S 转移酶和 Oshsp16.9的融合基因，因此可以存活，而与转化有 pGEX-

11、2T载体的 pGST cells 对比，对照细胞死亡。对两个菌株的细胞提取物在55下进行变性对比，pGST-FL菌株的蛋白的变性数目比pGST cells少50%.同样的结果在融合部分Oshsp16.9氮端78残基，但在碳端的108没有得到相同的结果（Yeh et al., 1997）。Pike等（2001）研究了在Synechococcus sp. PCC7942中表达的小热激蛋白在获得性耐热和转基因耐热中的所起的作用.有三个与sHSP同源性最低的基因，分别是OsHsp源自水稻细胞质，tom111源于番茄叶绿体，6803 Hsp源自Synechocystis sp. PCC6803都被转化到

12、E. coli同时过表达.研究发现表达的 sHSP 的热激蛋白能保护苹果酸酶不被热聚合；同样，可以保护一些可溶性蛋白，例如：Synechococcus sp. PCC7942 中的藻青蛋白（Pike et al. 2001）。Hsp 表达量的多少直接对植物的耐热性产生了不同的影响，可以通过反义和RNAi 的方式调节热激蛋白的表达量实现对植物耐热水平的调节。玉米和拟南芥的突变体中分别下调表达的Hsp100 蛋白，其诱导耐热能力降低（靳远祥和陈玉银， 2002）。Yang等（2005）研究表明，对番茄的 Hsp100/ClpB 基因沉默后番茄的耐热能力减弱。拟南芥获得性耐热是通过影响反义Hsp70

13、 来进行调节的，研究发现，缺少热激蛋白的突变体或者 RNAi 的植株即使经过热预处理，在热胁迫中仍然没有表现出耐热性（李竞芸等， 2007;裴华丽等, 2007）。Charng 等（2006）发现下调 HsfA2 导致突变体对高温更敏感了.研究还发现脱水应答元件结合蛋白或碳端重复结合蛋白（Dehydration Res-ponsive Element Binding protein, DREB/C-repeat Bin-ding Protein, CBF family）是转录调节蛋白，这些调节蛋白的功能包括耐干旱、耐盐胁迫、抵耐寒冷。近来研究表明，在拟南芥中DREB 是高温诱导和热激应答的一个

14、调控蛋白.Matsukura 等（2010）研究发现：HsfA3在热激的条件下被诱导与DREB2A有密切的关系.相反地，通过上调表达Hsp 提高了植物耐热性。有研究学者通过转基因胡萝卜细胞株并过量表达sHsp17.7,经修饰表达的sHsp17.7植株可以在高温胁迫下存活（吴莹和徐香玲， 2005; Zhou et al., 2012）。郭尚敬等（2006）种植转有过表达 sHsp 的烟草，发现转化的籽苗子叶打开速度明显加快。在水稻种中过表达Oshsp17.7不仅提高了水稻的耐热能力，也提高了对紫外线的抵耐能力（Murakami et al., 2004）。转化有Lehsp基因的烟草在 48时的

15、耐热能力高于转有反义构建的转化植株（黄冰艳等， 2005）。在转基因植物中，热激蛋白的表达通常是过量表达。Queitsch 等（2000）在拟南芥转基因植株中过量表达修饰AtHsp100可以使转基因植株在45的热胁迫中存活1 h,当去除热胁迫后可恢复正常状态，而转化空载体的对照植株在热处理后不能再正常生长.在水稻中过表达AtHsp100蛋白.同样，转化有AtHsp100基因的植株能够在热处理后恢复正常生长，而对照未转化植株不能恢复到与转化植株相似的生长状态（Katiyar-Agarwal et al., 2003）。2.2改变植物Osmolytes来提高植物耐热能力有研究表明，热激元件和热激转

16、录因子蛋白相互作用可以提高热激蛋白基因的转录量（Wu, 1995）。近几年，在转基因实验中通过热激蛋白转录因子调节热激蛋白表达量已经成为一种有效的调节方式。有研究表明AtHSF1是组成性表达，它的 DNA 结合活性、剪接活性、转录活性都在正常生长温度下被抑制，可以通过降低对 HSF （heat shock factor）功能的抑制来诱导产生热激蛋白（Lee and Sch觟ffl, 1996）。李春光等为了提高拟南芥的耐热能力，利用 CaMV35 作为启动子过表达Athsf3,转如到拟南芥，其耐热能力明显的升高（李春光等， 2005, 中国科学 C 辑， 35（5）：398-407）。在另外一

17、个独立的研究中，hsf3 基因在拟南芥中过表达，提高了拟南芥的耐热能力（Panchuk etal., 2002）。王冬梅等认为在番茄里过表达 hsfA1 基因，过表达株系耐热能力明显提高，另外，对该基因沉默的植株表现出热敏感（王冬梅等， 2003, 中国蔬菜, （2）： 58-60）。Matsukura 等（2010）研究了拟南芥中DREB2A对拟南芥的耐热能力的影响：在植物当中过表达D,拟南芥的耐热能力明显提高，对照除了该基因后，拟南芥的耐热能力下降.张宗申等（2001）认为某些低分子量的化合物例如氨基酸、聚胺类、季铵化合物、糖类和糖醇类，可以帮助植物适应大部分渗透胁迫（Gepstein e

18、t al., 2005）。这些化合物被称为渗透压调节剂。甜菜碱通过提高PSII的耐氧化能力能够起到保护光合作用机制的作用。在特定的温度下过表达甜菜碱基因表现出明显的生长优势。梁峥等（1997）将菠菜中的甜菜碱脱氢酶在烟草中过表达来提高甜菜碱的表达水平，提高了烟草转化株出幼苗生长期对高温的耐性.高银（2007）认为将微生物中的codA基因（编码胆碱氧化酶蛋白）导入拟南芥，可以提高转化植株在种子吸胀和发芽阶段比野生型植株有更高的耐热能力（Wanget al., 2010）。只有很少的研究通过过表达脯氨酸、甘露醇、海藻糖等方法提高植物渗透耐性来间接提高植物耐热能力（Wang et al., 2010

19、）。2.3改变植物细胞膜流动性来提高植物的耐热能力植物通过改变细胞膜油脂的构成来适应细胞外的低温环境.早在1983年，Murata （1983）就证明提高细胞膜脂肪酸去饱和酶活性能够提高植物对低温的的抵耐能力.在植物最佳生长温度下细胞膜饱和度的上升可以直接导致细胞膜的稳定提高.在转基因烟草中沉默了叶绿体的脂肪酸去饱和酶，研究发现纯和株系同野生型对比三烯脂肪酸的产量明显下降（Murakami et al., 2000）。耐热试验中转基因烟草可以在 42的热胁迫中抵抗2 h,野生型在相同条件下不能存活。Zhang 和Guy （2005）研究显示，在烟草中过表达油菜FAD8蛋白基因比过表达其他脂肪酸

20、去饱和酶使烟草对温度更敏感。2.4改变细胞内排毒作用的成分来提高植物的耐热能力在胁迫和正常条件细胞中都会产生活性氧簇（re-active oxygen species, ROS），然而在胁迫条件下活性氧簇的表达量迅速提高（Alscher et al., 2002）。叶绿体和线粒体的电子传递链是过氧化物的主要来源：在电子传递链产生能量的同时产生了氧自由基.生物系统通过两种机制来减少氧自由基的产生：一种是限制它的形成；另外一种是提高对活性氧的耐性.研究表明可以利用细胞解毒物质在转基因植物中表达，以改变植物耐热应答.在拟南芥过表达大麦的hvapx1基因后，使得转化株具有更高的耐热能力（Shiet a

21、l., 2001）。Chen 等（2004）在烟草中过表达番茄的谷胱甘肽过氧化物酶，短暂的表达提高了植株耐盐碱和耐热的能力.Tang 等（2006）和 Jiang 等（2009）发现过表达锌铜超氧化酶也可以提高植物耐热能力.在热处理条件下，因为错折叠和聚合，细胞蛋白失去其生物学活性.研究表明那些在热处理条件下的错折叠和聚合细胞蛋白对细胞有毒，不正常的蛋白激活了组织中激活热激蛋白基因表达.热激蛋白可以提高特殊蛋白酶的合成，包括降解非正常的蛋白（Katiyar-Agarwal et al., 2001）。有研究指出热激蛋白作为分子伴侣可以保护细胞免于热伤害。Hsp16.9、Hsp17.1、Hsp1

22、7.3和Hsp18.1在热激过程中可以防止蛋白聚合或者变性（Jiang et al., 2009）。在恢复阶段Hsp100 通过对在热处理条件下产生的聚合体进行再溶、修复。一些其他的热激蛋白 Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90单独或者协同作用稳定热变性蛋白（Buch-ner, 1999）。在不同的模式生物中，例如拟南芥、酵母和人类细胞，表现出一些不同的热激蛋白都扮演着重要角色（Dragovic et al., 2006）。综上所述，过表达热激蛋白，提高渗透压调节剂积累量，特异性的改变细胞膜的流动性和提高细胞解毒酶的表达量都能提高转基因植物的耐热能力.研究证明，热激蛋白以分子伴侣的形式来减少蛋白质的变性提高植物的耐热能力.然而，其它三种途径提高植物耐热能力仍然存在争议.细胞渗透调节剂可能通过创造具有强还原性的高能细胞环境来减少高温对蛋白质的破坏.有研究表明，渗透调节剂与细胞蛋白结合来防止蛋白质变性或者聚合（Ignatova andGierasch, 2006）。细胞解毒成分也是通过减少蛋白质失活来实现耐热能力的提高.细胞膜流动性可能在细胞形态和压力水平上扮演着重要角色。研究发现，细胞膜的物理状态会影响基因的表达