聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳ppt课件

1、1,聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 一、实验简介 1、实验目的 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验，初步掌握聚焦电泳的基本原理和实验技术,2,2、基本原理 2.1蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质.在不同的pH环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时的pH为该蛋白质的等电点。在电场下不泳动,3,2.2.等电聚焦 在常规电泳中,通常只是在恒定的缓冲液中进行分离，假定有A, B两个蛋白质组分，分别带有净电荷-3和+1。在一个pH9的缓冲洗脱中,带负电荷的蛋白质均放在靠阴极一侧电泳,此时带负电荷多的A蛋白质受阳极影响大,泳动速度比B快,最终会超过B，这样二者就会得到分离。 在

2、等电聚焦电泳中，分离是在连续的pH梯度中进行的。如果把A,B二者的混合物放在一个pH3.5-10的pH梯度中的pH6的位置，则A蛋白质的净电荷为-2,减少两个净电荷；B蛋白质的净电荷为+2，多了两个净电荷。在相同的电场下,A移向阳极,B移向阴极，当它们达到净电荷为零时停止迁移，这种行为称为聚焦反应,4,蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，这是一个”稳态”过程,一旦达到等电点的位置，蛋白质就会停止迁移。达到稳态后，如果它要正极或负极任何一侧扩散，均会受到相应的pH制约，即若向负极扩散带负电,会受到阳极的影响，迫使其扩散后退回原位;若向正极扩散带正负电,会受到阴极的影响，迫使其扩散后退

3、回原位。因此，蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄带,5,6,2.3.两性电解质 (1) Ampholine(瑞典LKB) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5,7,2) Servalyte(德国Serva公司) 它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10,8,3) Pharmalyte (瑞典Pharmacia) 七氨基多羧基组成的 pH范围: 2.5-5, 4-5.5,

4、 5-8, 8-10, 3-10 等,9,4)载体两性电解质(军事医学科学院) 合成的方式与Ampholine基本相同. pH范围: 3-9.5, 3.5-5.5, 4.0-6.0, 5.0-7.0, 6.0-9.0, 7.0-10.0,10,3 pH梯度的形成 3.1在电场下载体两性电解质的变化 在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零. 引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁

5、移,11,1)靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阴极顺延; (2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI,一直向阳极顺延。如图,12,13,3.2pH梯度的形成过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图,14,15,16,4、实验流程 等电聚焦凝胶溶液配制 安装

6、电泳槽、调水平 铺胶 加样 电泳 停止电泳 取胶固定 染色、脱色,17,二、实验方法 1、仪器准备及清洗 (1)电泳槽,玻璃板三块, 塑料模板 (2)烧杯 50 ml 一个 (3)量筒100ml一个 10 ml一个 (4)大培养皿 一个,18,2、配试剂(每组用量) （1）固定液100ml 三氯乙酸10g 磺基水杨酸3.5g 95%乙醇35ml 加蒸馏水至100ml (2)脱色液100 ml 95%乙醇10 ml 冰醋酸7.5 ml 加蒸馏水至100ml,19,3、实验步骤 (1) 安装电泳槽,调水平(先平放两块相同厚度玻璃板,上放塑料模板,一头用铁夹夹住,20,2)配凝胶溶液 单体 2ml

7、Ampholine 0.5ml ddH2O 5.5ml TEMED 8l 10% AP 50l,21,3)灌胶, 聚胶60分钟 (4)取下玻璃板, 电泳槽上加少许液体石蜡,将坐标纸浸透铺平整, 坐标纸上放带胶玻璃板 (5)加电极条:取4张滤纸条,其中两张滤纸条浸透1mol/L 磷酸,另两张浸透1mol/L NaOH, 多余的液滴用滤纸质吸去,然后对称放在凝胶的两侧,22,6)剪取加样纸: 按坐标纸的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加样纸,拨去上下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层). (7)加样: 将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的凝胶中央. (8)连接电极: 将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂金丝压在电极条上.盖上安全罩,接通冷凝水,23,9)电泳: 将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连, 负极输出端与NaOH电极条相连,接通电源,60V恒压15min, 8mA恒流至电压上升到 550V,关闭电源,揭去加样纸, 然后在550V恒压3小时左右,等电流降至接近于零,停止电泳. (10)固定: 取出凝胶,浸泡在40ml的固定液中 摇动约30min,倾出固定液.再加入60ml的固定液过夜. (11)染色