萤光素酶报告基因技术.ppt

1、Report Smartly萤光素酶报告基因技术,自然界的萤光,发光海星发光甲壳虫,发光真菌,发光节虫,自然界的萤光,发光鱼发光甲虫,自然界的萤光,萤火虫,报告基因的作用,细胞信号转导途径 启动子/增强子 受体结合 病毒/细胞相互作用 转录因子 药物诱导作用或”效果,荧光 - Fluorescence 萤光 - Luminescence,Luminescence vs. Fluorescence,各种报告基因的优点和缺点,萤光素酶报告基因的主要优点,非放射性 检测快（比CAT等） 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍） 半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶分子。在哺乳

2、动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时） 线形范围广 （在10-16 M(10pg/L)至10-8 M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比） 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 (对多孔板而言) 生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力,萤光素酶报告基因的使用,原理: 制备含有 luc/ Rluc 的DNA 转染 提供刺激 测量萤光,调节序列,Luc,在活细胞中做报告基因检测,外界刺激(导引物,萤光素酶基因,蛋白质折叠,调节序列,加工,转录,转录因子,信号转导,翻译,反义

3、RNA,受体,蛋白-蛋白相互作用,RNA 酶,病毒感染和增殖,RNAi 抑制,启动子/增强子分析,碰撞启动子”: 全序列: 2) 逐步缺失,Promoter,luc,Light,Promoter,luc,Light,Promoter,luc,Firefly and Renilla,萤火虫生物萤光的化学,萤光素,ATP + O2,萤光素酶,Oxyluciferin + AMP,PPi + CO2 + Light,萤光素酶: 单体, 61,000 Daltons,辅-底物: ATP . Mg 2,萤光素,Mg2,海肾萤光素酶反应,Coelenterazine,O2,萤光素酶,Coelenteram

4、ide,CO2 + Light,萤光素酶: 单体, 36,000 Daltons,萤光素: (Coelenterazine,Enzyme structures,Firefly,Renilla,为什么要使用双报告基因,报告基因 A (首要信号,报告基因 B (第二信号,特异生物学反馈 + 非特异生物学反馈,非特异生物学反馈,检测结果,比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈,细胞可能有内源脱乙酰基酶 -Gal 或 GUS 活性. CAT, -Gal 和 GUS 检测是终点检测. 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal ,的两个报告基因的检测都灵敏而快速,传统的双报告基因的缺点,双萤

5、光素酶报告基因系统比用CAT和-Gal做内对照的优点,速度 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成 灵敏 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低 方便 一管完成检测，样品不必分份,实验质粒,对照质粒,用海肾萤光素酶作对照归一实验变化,归一反应,对照的（海肾萤光素酶,实验的 (萤火虫萤光素酶,萤火虫萤光素酶,海肾萤光素酶,用两个萤光素酶做报告基因 （萤火虫+海肾,数据处理举例,第一天萤光素酶活性(RLU) 比率 归一的活性 样品处理重复（F:R) 变化倍数 对照 5,128 2,511 7,553 3,815 10,555 5,413 7,745 3,913

6、1.981.00 处理 5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232 11.525.82 处理B 1 587,635 5,144 988,347 8,832 3 409,881 3,564 661,954 5,847 113.2157.18 第二天 对照 15,529 20,433 0.76 21,897 30,841 0.71 10,760 13,620 0.79 16,062 21,631 0.741.00 处理 850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154

7、41,3055,81 处理D 1 14,865 19,3-05 8,967 12,284 13,767 20,246 12,533 17,278 0.730.99,活性倍数 (F/R)样品 = F/R)对照 第二天处理计算如下： 活性倍数 (791,021/19,154) = （16,062/21,631) = 55.81,GloMax 20/20Single tube luminometer,GloMax 96 luminometer,White microplates for luminescence,Promega公司出品的双报告基因实验产品,质粒 萤火虫萤光素酶质粒 海肾萤光素酶质粒

8、叩头虫萤光素酶质粒 检测系统 非均质双报告基因检测系统（通量较低） 均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化,载体 - 萤火虫萤光素酶载体,pGL3 家族 pGL3-Basic pGL3-Control pGL3-Enhancer pGL3-Promoter,pGL3-Basic Map,pGL3-Control Map,pGL3-Enhancer Map,pGL3-Promoter Map,辅助报告基因的相对萤光单位 (RLU) 启动子交叉交谈或互相干扰 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节,内对照载体可能存在的问题,载体 - 海肾萤光素酶报告基因载体,Renilla 萤光素酶载体系列,

9、内含子,T7 启动子,CMV即时早期增强子/启动子,phRL-CMV,HSV TK 启动子,phRL-TK,SV40 晚poly(A,SV40 早期 增强子/启动子,phRL-SV40,MCS,phRL-null,hRL 基因,TK 启动子,phRL-TK(Int,MCS,phRG-B,合成 poly(A) 信号 转录停止位点,三个读码框的终止密码子,phRG-TK,合成 poly(A) 信号 转录停止位点,三个读码框的终止密码子,TK 启动子,hRL 基因,SV40 晚 poly(A,Renilla 萤光素酶载体系列,用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因,Dual-Luciferase 双萤

10、光素酶报告基因系统（非均质检测） E1910，100次 E1960，E1980，1000次 Dual-GloTM 萤光素酶检测系统 （均质检测） E2920，10ml E2940，100ml EE2980，10X100ml,均质检测与非均质检测,发光,细胞+培养基,添加试剂,细胞+培养基,除去培养基,发光,清洗细胞,裂解细胞,添加试剂,均质检测,非均质检测,Dual-Luciferase报告基因检测系统组分,检测缓冲液II 底物（冻干粉） Stop&Glo缓冲液 Stop&Glo底物,50X 被动裂解液,5X,Dual-Luciferase报告基因检测步骤,裂解细胞 被动裂解 除去培养基.PB

11、S洗.加1XPLB, 振荡15分钟.检测 主动裂解 除去培养基.PBS洗.在1XPLB中刮下细胞.细胞转移到试管或小瓶中.1-2次冻融.检测 检测,双萤光素酶检测方案,1 支试管 2 步检测 30 秒钟,Luciferase Assay Reagent II,Passive lysis buffer,Stop&Glo Reagent,DLRTM For HTS,DLR双报告基因检测系统应用举例,黑色素刺激激素(-MSH)对由人酪氨酸酶启动子增强子控制的萤光素酶的表达的诱导(Promega eNotes) 目的：监测细胞对-MSH诱导的应答 材料： 实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启

12、动子增强子Luc(+) 阳性对照：pGL3-Control 阴性对照：pGL3-Basic 内对照：pRL-SV40 B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR 双萤光素酶检测试剂盒,步骤 前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组） pGL3-Control和 pRL-SV40 pGL3-Basic和 pRL-SV40 裂解细胞，测量萤光,Dual-Glo萤光素酶检测系统,检测特点 均质检测，为高通量检测而设计 萤光信号稳定，2hrs内检测 自发萤光低于检测水平,Dual-Glo Assay: 同一样品中检测两种萤光信号,

13、Stable luminescence signals for both reporters (t1/2 3.5 hrs.) 10,000-fold signal separation between the firefly and Renilla bioluminescence,Primary reporter: Firefly bioluminescence,Secondary reporter: Renilla bioluminescence,Cells in culture medium,Add fireflyassay reagent,Add combination firefly

14、quench reagent& Renilla assay reagent,Dual-Glo assay-选择性淬灭萤火虫萤光,Selective quench of firefly luminescence,Dual-Glo萤光素酶检测系统,试剂盒组成 Dual-Glo萤光素酶缓冲液 Dual-Glo萤光素酶底物（冻干粉） Dual-GloStop-Glo缓冲液 Dual-GloStop-Glo底物,操作步骤,试剂制备简单 将Dual-Glo 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo 萤光素酶底物中 用Dual-Glo Stop &Glo 缓冲液按1:100 稀释 Dual-Glo Stop &

15、Glo 底物 所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于 20C 两步加入试剂: 加, 读, 加, 读 10,000 倍信号分离 (淬灭,用两个萤光素酶做报告基因Chroma-LucTM载体Chroma-Glo检测试剂,E.Coli 表达的Chroma-LucTM 基因,Chroma-LucTM 基因和载体,三个基因: 1. CBRluc 发红光的萤光素酶 2. CBG99luc 发绿光的萤光素酶 99.0% DNA 相同于 CBRluc 3. CBG68luc -发绿光的萤光素酶 68.9% DNA相同于 CBRluc 两种载体骨架: 1. 对照 置换了 pGL3-Control 的luc+ (

16、pCBR-Control, pCBG68-Control, and pCBG99-Control) 2. Basic 置换了 pGL3-Basic 的luc+ (pCBR-Basic, pCBG68-Basic, and pCBG99-Basic,合成的 Chroma-LucTM 萤光素酶载体骨架,Control Basic Enhancer,SV40 启动子,SV40 增强子,SV40 增强子,合成的或天然的基因,Chroma-Glo 检测的化学,Luciferin,ATP + O2,Luciferase,Oxyluciferin + AMP,PPi + CO2 + Light,Lucife

17、rase: Monomeric, 61,000 Daltons,Co-substrates: ATP . Mg 2,Luciferin,不同颜色，同样试剂,C2,C2,旋转，较少能量，红光,不旋转，较多能量, 黄绿光,Chroma-LucTM 萤光素酶滤光片选择,510/60nm,610nm Long pass,Chroma-Glo 检测的特点,为高通量检测设计，检测96-、384-孔板 均质检测 需要带滤光片的萤光发光计,pGL4: A New Family of Reporter Vectors,Next generation reporter vectors (pGL4,Improved

18、 Reporter Performance,Improved Expression of luc2,Provides 5 -10 x higher expression than luc+ in mammalian cells,Large reduction of consensus sites where inappropriate interactions with host may occur,Sites removed from vector, reporter genes, and selectable markers: Restriction sites Vertebrate TF

19、 binding sites Promoter modules Eukaryotic splice acceptor and donor sites Eukaryotic poly A sites Kozak sequences,Reduction in Consensus Binding Sites,Increased Response Using Rapid Response Luciferases,Compared to regular luciferase, Rapid Response luciferases gave higher induction in shorter time

20、,Induction at 3h,192,79,150,为什么需要快速反应萤光素酶基因？（现存报告基因的缺点） 研究者想要报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联 需要更强的应答 较长的敷育时间可能导致检测到次级效应(假阳性,Rapid ResponseTM 报告基因技术(不稳定的萤光素酶基因,细胞内报告 基因池,信号,新表达的 报告基因,为什么快速应答的报告基因应答性更强,快速应答,非-快速应答,新表达的 报告基因,信号,基于报告基因稳定性的动力学模型,pGL4 Rapid Response Reporters Gene Design,VectorGeneDesign pGL4.10 luc

21、2luc2 pGL4.11 luc2Pluc2P pGL4.12 luc2CPluc2CP pGL4.70 hRluchRluc pGL4.71 hRlucPhRlucP pGL4.72 hRlucCPhRlucCP,快速应答报告基因的设计,蛋白降解序列 来自PEST鼠鸟氨酸脱羧酶的序列 (40 aa) 来自酵母CL1 序列 (18 aa) RNA 降解序列 根据saimiri疱疹病毒小核 RNA合成的富 AU 因子 (ARE) 萤光素酶基因 为哺乳动物细胞表达优化了密码子 优化了翻译起始序列 (如, Kozak 序列) 缺失了多数已知的转录因子保守结合位点序列,New Multiple Cloning Region,pGL4 载体系列的优势,更亮的萤光 Codon optimized for m