生物化学：13 Protein Biosynthesis(94-5)

1、Chapter 13 Protein Biosynthesis,Second step of gene expression Translation，posttranslational modification，targeting. Genetic code Ribosomes Role of tRNA（adapter for codon and a.a） Site of action of antibiotics,要求,1. 理解蛋白质合成的信息来源，三种RNA在蛋白 质合成中的作用 2. 理解遗传密码的破译方法 3.遗传密码的几个重要特性 4.了解核糖体的结构、掌握氨酰-tRNA合成酶的

2、作用机理 5.了解蛋白质的合成过程 6.了解多肽链的折叠与加工过程，各类蛋白质的 投递过程,蛋白质合成,第一节 遗传密码 Genetic Code,一、遗传密码的破译 1. 同聚核苷酸 polyU, polyC, polyA, polyG polyU + E.coli.无细胞体系 Phe polyC(Pro), polyA(Lys), polyG(Gly),2. 随机顺序多核苷酸 多聚核苷酸磷酸化酶，不需模板。 nNDP （RNA）n + nPi 在体外合成顺序随机的RNA ，RNA的组成 由核苷酸的相对浓度决定。 举例： 无序polyUG对氨基酸的编码，U : G = 5 : 1,可能的密码

3、子 几率 相对频率 a.a相对量 Phe UUU 0.587 100 100 Leu UUG 0.116 20 20 Cys UGU 0.116 20 20 Val GUU 0.116 20 20 Trp UGG 0.023 4 4 Val GUG 0.023 4 4 Gly GGU 0.023 4 4 Gly GGG 0.0046 0.8 0.8 无法区分UUG是Leu，还是Cys,3. 人工合成序列重复的RNA H.G.Khorama，M.W.Nirenberg和Holly分享1968诺贝尔奖。 合成二核苷酸重复序列： CUCUCUCUCUCU 翻译产物：Leu-Ser-Leu-Ser-L

4、eu-Ser 合成三核苷酸重复序列： UCCUCCUCCUCCUCC 翻译产物：Phe-Phe，Ser-Ser，Leu-Leu,密码子,二、遗传密码的特点 1. 密码子是连续的,读码框、移码、移码突变、缺失突变,2. 遗传密码一般不重叠 大肠杆菌噬菌体（R17 、Q）的RNA基因组中，部分基因的遗传密码重叠。 3. 简并性 大多数a.a有几组不同的密码子，Trp及Met只有一个密码子。 简并性可以减少有害的突变。,部分基因的遗传密码重叠,部分基因的遗传密码重叠,遗传密码重叠,4. 密码子中第三位碱基具有较小的专一性 专一性由前二位碱基决定，第三位基具有摆动性 Ala（GCU、GCC、GCA、G

5、CG）。 第三位碱基突变时，仍然能译出正确的氨基酸。 酵母tRNAAla的反密码子是IGC，可阅读GCU、GCC 和GCA,密码子与反密码子,密码子与反密码子,第三位碱基具有摆动性,5. 起始密码子 AUG-Met 终止密码子 UAG、UAA、UGA 6. 密码子近乎完全通用 病毒、细菌、真核生物的密码子近乎完全通用，但线粒体DNA中密码子有例外。,线粒体DNA中的密码子,第二节 蛋白质合成中的大分子,一、mRNA 1. 原核mRNA 起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体结合、富含嘌呤的3-9个核苷酸的保守序列AGGA，此序列称SD序列。 它与核糖体小亚基内16S rRNA

6、的3端一段富含嘧啶的序列GAUCACCUCCUUA-OH互补，使得结合于小亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。,SD sequence,许多原核mRNA（多顺反子） 翻译时，各种蛋白质都有自己的起始、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止。,2. 真核mRNA结构 真核mRNA具有m7GpppN帽子结构，无SD序列。帽子结构具有增强翻译效率的作用。 若起始AUG与帽子结构间的距离太近（小于12个核苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下游适当的AUG起始翻译。当距离在17-80个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。,真核mRNA具有“第一AUG规律”，即当5端具有

7、数个AUG时，其中只有一个AUG为主要开放阅读框架的翻译起点。 起始AUG二个特点 （1）AUG上游的-3经常是嘌呤，尤其是A （2）紧跟AUG的+4常常是G 起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率最高。 若-3不是A，则+4必须是G。无此规律的AUG，则无起始功能。,二、tRNA和氨基酸,20种氨基酸，60-120种tRNA，氨酰-tRNA 合成酶至少20种。tRNA功能 A. 专一性结合氨基酸，使氨基酸活化 B. 识别氨基酸密码子，依靠核糖体的特定 位点对mRNA的密码子进行识别 每一个细菌细胞内约有60种tRNA（至少有31-32种），真核细胞可达100-120种。 同一种氨基酸

8、能够连接到多种tRNA上，这一组能运载同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。,1. 氨酰-tRNA（氨基酸合成肽链的活化形式） 氨基酸在掺入肽链前必须活化，以获得足够的能量。 活化反应由各种氨酰-tRNA合成酶催化 A. 氨酰基-tRNA的合成 氨基酸+tRNA+ATP = 氨酰-tRNA+AMP,氨酰基-tRNA,B. 氨酰-tRNA合成酶 每一种氨基酸至少有一种氨酰-tRNA合成酶。一种氨基酸可以对应于多种tRNA。氨酰-tRNA合成酶可以接受同种氨基酸的几种同工tRNA。 氨酰-tRNA合成酶对氨基酸具有极高的专一性，且只作用于L-氨基酸。确保每一种氨基酸与其对应的tRNA结合（含同工

9、tRNA），减少多肽合成的差错。,氨酰-tRNA合成酶,2. 氨酰-tRNA的功能 A. 是氨基酸合成肽链的活化形式 B. 氨酰-tRNA上的tRNA能识别mRNA上的密码子，掺入正确的氨基酸 氨基酸一旦与tRNA形成氨酰-tRNA后，氨基酸的去向就完全由tRNA决定，实验证明。,三、核糖体 Ribosome,原核细胞约2000个，真细胞106-107个。核糖体是一个大的核糖核蛋白体，由大亚基和小亚基组成，是蛋白质合成场所。 1. E.coli.核糖体结构 70S: 30S and 50S subunit 30S: 16s rRNA and proteins（S1-S21） 50S: 5s r

10、RNA，23S rRNA and protein（34） 在16S rRNA的3端有一段富含嘧啶的序列， 可以识别、结合mRNA的SD序列。,2. 真核生物核糖体结构 80S: 40S and 60S subunit 40S: 18S rRNA and proteins（30） 60S: 5S rRNA，5.8S rRNA， 28S rRNA and proteins （50） 3. 核糖体结构模型 50S 亚基上有两个tRNA位点：氨酰基位点（A） 和肽酰基位点（P） 50S与30S接触面上有一个mRNA结合位点。,4. 多核糖体 在一个mRNA上有多个核糖体，它们能分别合成一条完整的肽链。

11、 可提高蛋白质合成的效率。,Polyribosomes,四、辅助因子,蛋白质合成中，有一些蛋白质因子在不同阶段起作用。主要有：起始因子、延长因子、终止因子（或释放因子），此外还有ATP、GTP、Mg2+等参与。 原核： Initiation Factor（IF1, IF2, IF3） Elongation Factor（EF-Tu, EF-Ts, EF-G） Termination Factor（RF1, RF2, RF3）,第三节 蛋白质生物合成过程,一、原核生物蛋白质的合成 1. 起始 细胞中有两种携带Met的tRNA： tRNAf和tRNAm A. 起始氨基酸 N-甲酰甲硫氨酰-tRNA

12、（ fMet-tRNAf） 甲酰化酶催化Met-tRNAf上的Met -NH2甲酰化，此酶不能催化Met或Met-tRNAm甲酰化。N10-甲酰FH4+Met-tRNAf,N-甲酰甲硫氨酸,B. 70S起始复合物的形成 30S核糖体在IF3帮助下识别、结合mRNA上的SD序列。,SD序列与16S rRNA结合,2. 肽链的延长 A. 氨酰-tRNA进入A位点氨酰-tRNA进入后， Tu-GDP解离释放出来。 B. 肽链的形成 肽酰基从P位点转移到A位点， 形成一个新的肽链。A位点的氨酰-tRNA上 的-NH2与P位点上的肽酰tRNA的-COOH形成 新的肽键。 C. 移位 核糖体沿mRNA移动

13、，每次移动一个 密码子的距离。,3. 肽链合成的终止 终止密码子：UAA、UAG、UGA RF1识别UAA、UAG RF2识别UAA、UGA RF3协助肽链释放 RF1、RF2可能使P位点上的肽酰转移酶的活力转变为水解活力。,4. 蛋白质合成中的能量 合成一个二肽 甲硫氨酰-tRNA ATP-AMP 2 70S起始复合物 GTP-GDP 1 a.a-tRNA ATP-AMP 2 a.a-tRNA进入核糖体 GTP-GDP 1 核糖体移位 GTP-GDP 1,合成二肽（形成一个肽链）需7个高能键，其后每加一个氨基酸需4个高能磷酸键。 例：合成200个氨基酸残基组成的多肽， 需要多少个高能磷酸键？

14、 7 + 1984 + 1 = 800（4n）,5. 肽链合成的方向和速度 方向（mRNA、肽链），mRNA从5端向3，多肽从N端向C端。 速度：E.coli.每秒约15个氨基酸。细菌mRNA 寿命很短，mRNA必须以最高效率被 翻译。 翻译的高效性表现在两方面： a转录和翻译偶联 b多个核糖体翻译同一条mRNA链,转录和翻译偶联,二、真核细胞蛋白质生物合成,1. 核糖体不同 真核80S，原核70S 2. 起始tRNA不同 真核：Met-tRNAm 甲硫氨酸 原核：fMet-tRNAf 甲酰甲硫氨酸 3. 起始密码子 真核 AUG，原核 AUG（有时GUG） 4. 起始因子 真核eIF ，真核

15、CBP帽结合蛋白 （cap-binding protein）CBP和IF4F与mRNA的5端帽子结合,三、mRNA的结构与翻译,1. 原核生物多顺反子mRNA的翻译 各个顺反子（即基因之间），常有一段非编码的间隔区。不同间隔区的长度变化，可以在1-100个之间，甚至可以重叠。 乳糖将纵子 产物 Z基因产物：半乳糖苷酶 1 Y基因产物：半乳糖透性酶 0.5 A基因产物：半乳糖乙酰化酶 0.2,Operon,2. 真核生物双功能mRNA 极少数真核mRNA 上可能从两个不同AUG起始合成蛋白质。若两个AUG属于同一阅读框，则形成两个长短不同的蛋白质，其中有部分多肽完全相同。若两个AUG处于不同的阅

16、读框中，则合成两个序列完全不同的蛋白质。一条mRNA可合成两种蛋白质，称双功能mRNA。,3. 只有一个终止密码子的多基因mRNA的翻译 真核生物的泛肽（Ubiguitin）基因。 酵母有5个泛素基因，重复组成基因簇。 人类有9个，每个基因编码76个氨基酸的泛肽 泛肽羧端水解酶可识别泛肽的空间构象，当翻译进行到一个单位出来后，泛肽的空间构象形成，这种酶可切下泛肽单位。,四、蛋白质内含子,90年代初，发现了两类新的内含子。 蛋白质内含子：DNA序列与外显子一起转录和翻 译，产生一条多肽链，然后从肽链中切除与内 含子对应的氨基酸序列，再把与外显子对应的 氨基酸序列连接起来，成为有功能的蛋白质。 翻

17、译内含子：mRNA中存在与内含子对应的核苷 酸序列，在翻译过程中这一序列被“跳跃”过 去，产生的多肽链不含有内含子对应的氨基酸序列。,五、蛋白质合成的抑制剂,1. 嘌呤霉素 嘌呤霉素的结构与氨酰-tRNA3端上AMP残基十分相似，肽酰转移酶能使肽酰基与嘌呤霉素结合，生成肽酰嘌呤霉素。,2. 链霉素（新霉素、卡那霉素） 抑制原核生物蛋白质的起始合成，导致读码错误。 链霉素是一种强碱性三糖，在高浓度下干扰甲酰 Met-tRNA与核糖体小亚基结合，从而抑制蛋白质 合成的正确起始。在低浓度下，引起mRNA读码 错误。例如，以polyU为模板，加入链霉素后除Phe 外，Ile也能掺入多肽链。 30S小亚

18、基上的S12蛋白质，决定着小亚基对链霉 素的敏感性。,链霉素,3. 四环素类 四环素、土霉素、金霉素均属于四环素类，可与 30S小亚基结合，阻碍氨酰-tRNA与30S小亚基和 mRNA结合。 4. 氯霉素（结合70S核糖体，阻止移位） 抗生素抑制对核糖体循环的起始和延长。 由于细菌的核糖体与哺乳动物线粒体的相似，这类 抗生素也可抑制真核生物线粒体内蛋白质的过程。,四环素,氯霉素,第四节 多肽合成后的定向输送与加工,Targeting and Sorting 新生多肽的输送是定向进行的 大肠杆菌的新生肽都在胞质中合成。合成的多肽一部分留在胞质中，一部分送至质膜、外膜，还可分泌至胞外。 真核新生肽

19、在胞质中起始合成。一部分在胞质中，另一部分送往溶酶体、线粒体、叶绿体、细胞核等。,一、蛋白质的跨膜转运与肽链折叠,1. 膜蛋白与分泌蛋白的跨膜转运 信号肽（signal sequence）： 带有蛋白质去向信息的多肽，15-36个氨基酸组成，氨基端至少含有一个带正电荷的氨基酸。中部有一段由7-13个疏水氨基酸组成的肽链，如Ala、Leu、Ile、Val、Phe。,信号肽,信号识别体（signal rccognition particle ，SRP）: 识别信号肽的核蛋白体，由一分子7SL RNA和6个不同的多肽分子组成。7SL RNA上有两段核苷酸序列，称Alu序列。 SRP功能（两个功能域）: A. 识别信号肽 B. 干扰氨酰-tRNA及肽酰转移酶，暂时终止 多肽链的延伸 C. 与停泊蛋白结合,SRP受体停泊蛋白（docking protein DP）: 在内质网上与SRP-核糖体复合物专一性结合的蛋白质。 DP