表达芯片培训手册0607版

1、Affymetrix 表达谱芯片实验培训手册2006年7月目录一 总RNA的提取和纯化1. 提取总RNA2. 总RNA的定量和质检3. 纯化总RNA4. 纯化总RNA的定量和质检二 CDNA的合成和纯化1. 1stcDNA的合成2. 2ndcDNA的合成3. 纯化双链cDNA三 IVT合成cRNA和cRNA的纯化1. IVT合成cRNA2. 纯化cRNA3. cRNA的定量和质检四 cRNA片段化、配制杂交液1. 片段化cRNA2. 片段化cRNA的质控3. 配制杂交液五 芯片杂交1. 预杂交芯片2. 杂交液的准备3. 杂交芯片六 洗脱芯片七 扫描芯片一 总RNA的提取和纯化1. 提取总RNA

2、（要求最低18 ug）a. 提取（用Invitrogen的TRIzol提取）I. 如果是TRIzol 保存的细胞直接进行II步；如果是组织，在液氮中研磨成粉末。II. 待液氮挥发干，立即加入TRIzol，每100mg组织加1ml TRIzol，融化后，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入1.5ml离心管中，室温静置35分钟。III. 在离心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿，振荡混匀。IV. 将离心管在4,12000rcf，离心15分钟。V. 用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，每ml TRIzol起始量加入500ul异丙醇。VI. 20,沉淀35 min以上。VII.

3、4,12000rcf，离心10分钟。VIII. 小心移出上清。IX. 沉淀中加入1mL 75%乙醇，4,12000rcf，离心10分钟。X. 重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀。XI. 去上清，稍微晾干，RNA略显透明，加入适当体积（30 ul）的RNase-free的水，充分溶解。2. 定量和检测总RNAa) 紫外定量和检测I. 用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。II. 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.92.1之间)。b) 变性胶电泳质检I. 配制1.2%

4、 的电泳胶10 MOPS Gel Buffer 10mlAgrose 1.2gRNase-Free Water 90ml加热溶解Agrose，稍微冷却，加入37%甲醛 1.8mlEB(10mg/ml) 1ul摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1 MOPS Gel Buffer中平衡10分钟，待用。II. 样品变性5Loading Buffer 2ulRNA样品 1ugRNase-Free water 调节至10ul在65，变性5分钟，立即置于冰上冷却。III. 电泳将处理好的RNA样品，稍微离0心， 70V恒压电泳1小时。在凝胶成像仪上观察结果。C）生物分析仪分析RNA完整性3. 纯化

5、总RNAQIAGEN的RNeasy Mini Kit（总RNA量大于45 ug）或Micro Kit（总RNA量小于45 ug）。RNeasy Mini KitI. 将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul，(因QIAGEN纯化柱的最大上样量为100ugRNA，所以一般取RNA不大于100ug)。II. 加入350ul RLT工作液(1ml RLT 中加10ul beta-ME，混匀而成)，充分混匀。III. 加入250ul 无水乙醇，充分混匀(不要离心)。IV. 将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，8000rcf，离心15秒。V. 弃滤液，加入500ul RPE

6、工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心15秒。VI. 弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心2分钟。VII. 将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1分钟。VIII. 将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加30ul RNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。IX. 将EP管中的样品移入一个新的EP管中。RNeasy Micro Kit1 将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul。2 加入350ul RLT工作液(1ml RLT 中加10ul 2-ME，混匀而成)

7、，充分混匀。3 加入250ul 无水乙醇，充分混匀(不要离心)。4 将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，8000rcf，离心15秒。5 弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，8000rcf，离心15秒。6 弃滤液，加入500ul 80%酒精，8000rcf，离心2分钟。7 将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速离心5分钟。8 将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加14ul RNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。4. 纯化总RNA的定量和检测a紫外定量和检测:总RNA的浓度和OD260/OD280。b变性胶电泳质检:

8、二 cDNA的合成和纯化1. 1stcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)a) 总RNA 18ug RNase-free water 补至8ulb) T7-(dT)24 Primer(50uM) 2ul稀释好的 poly-A control 2ul混匀，70温浴10分钟，置于冰上至少2分钟，离心片刻；c) 51st Strand Buffer 4ulDTT (0.1M) 2uldNTP (10mM) 1ul混匀，42，温浴2分钟；a) SuperScript II RT(200U/ul) 1uL(18ug起始) b) 混匀，42,温浴1

9、小时。2. 2ndcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)a) 将1st cDNA合成产物置于冰上，加入下列试剂：Component VolumeRNase-Free water 91ul52nd Strand Buffer 30uldNTP(10mM) 3ulE.coli DNA Ligase(10U/ul) 1ulE.coli DNA Polymerase(10U/ul) 4ulE.coli RNase H(10U/ul) 1ulTotal Volume 130 ul 混匀，16，反应2小时；b) 加入2ul T4 DNA Polym

10、erase，混匀，16，5分钟；c) 加入10ul EDTA(0.5M)，混匀，终止反应。-20保存或进行下步纯化。3. 纯化cDNA( Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module)a) 将600 ul cDNA Binding Buffer加入cDNA合成产物中，振荡混匀3秒。b) 将500ul液体移入cDNA Cleanup Spin Column管中，不要振荡，=8000rcf,室温离心1分钟，弃滤液。c) 将剩余液体移入cDNA Cleanup Spin Column管中，不要振荡，=8000rcf,室温离心1分钟，弃滤液。d) 换一个新收集管，

11、加入750ul cDNA Wash Buffer，最大转速离心1Min，弃滤液。e) 打开盖子，最大转速离心5Min，弃滤液。f) 将柱子转移至1.5mL的收集管中，加入14ul的cDNA Elution Buffer。室温静置1分钟，最大转速离心1分钟。三 cRNA的合成和纯化1. IVT合成cRNA(GeneChip IVT Labeling Kit)Reagent VolumeTemplate cDNA 12 ulRNase-Free water 8 ul10IVT Labeling Buffer 4ulIVT Labeling NTP Mix 12ulIVT Labeling Enzy

12、me Mix 4ulTotal Volume 40ul混匀，稍离心，37温浴16小时。合成产物可保存在-20或直接进行下一步纯化。2. 纯化cRNA（Genechip Sample Cleanup Module）1 加入60ul RNase Free水，振荡混匀3秒。2 加入350ul IVT cRNA binding Buffer, 振荡混匀3秒。3 加入250ul 无水乙醇，用加样枪混匀。4 将以上混合液加入cRNA Cleanup Spin Colum, =8000 rcf,离心15，弃滤液。5 将柱子移至1.5mL的收集管，加入500ul的IVT cRNA WashBuffer, =8

13、000 rcf,离 心15，弃滤液。6 加入500ul 80%乙醇, =8000 rcf,离心15，弃滤液。7 换一个收集管，打开盖子， 16000 rcf, 离心5min，弃滤液。8 将柱子转移至1.5mL的收集管，加入11ul的Rnase Free水，16000 rcf 1min。9 加入10ul的Rnase Free水， 16000 rcf 1min。cRNA的定量和检测a. 用紫外分光光度计测量cRNA的浓度和OD260 / OD280：b. 变性胶检测cRNA：取2ug cRNA在1.2%的变性胶上电泳，纯化的cRNA应该呈弥散状长条带。四 cRNA片段化、配制杂交液1. 片段化cR

14、NAa. 校正cRNA浓度根据公式： 校正cRNA= cRNAV-MRVcRNA：cRNA的测量浓度；V：cRNA的洗脱体积；M：合成cRNA时所用总RNA的量；R：cRNA的回收得率； 校正cRNA：cRNA校正后的浓度。b. 配制片段化反应体系根据校正cRNA的浓度片段化(30ul)：cRNA 15ug5Fragmentation Buffer 6ulRNase-Free Water 补充至 30ulc. 片段化混匀，94温浴35分钟，之后置于冰上。d. 片段化cRNA的质检：变性胶电泳质检，片段化cRNA约为35200bp。2. 配制杂交液根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液：配方300

15、ul终浓度1片段化cRNA(0.5mg/ml)30 ul0.05ug/ul2Oligo B2 对照(3nM)5ul50pM320Hybridizition control15 ul14鱼精DNA(10mg/ml)3 ul 0.1mg/ml5乙酰化BSA(50mg/ml)3 ul0.5mg/ml62杂交Buffer150 ul17 DMSO30 ul8RNase-Free Water64 ul 五 芯片杂交先进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片。1和2同时进行，直到第3步：1. 预杂交芯片I. 取出芯片，平衡至室温；II. 加入1杂交Buffer；III. 45，6

16、0rpm，预杂交10分钟。2. 杂交液的准备I. 杂交液混匀，离心片刻；II. 99，温浴5分钟；III. 将杂交液转至45，温浴5分钟；IV. 离心机最大转速 (16000 rcf) 离心5分钟。3. 杂交芯片I. 吸出芯片中的1杂交Buffer；II. 将杂交液加入到芯片中；III. 45，60rpm，杂交16小时；杂交结束后，吸出芯片中的杂交液，加入洗液 A，进行后面的洗染过程。六 洗脱芯片在洗脱工作站上按照芯片类型，运行洗脱程序。七 扫描芯片扫描仪上扫描芯片。八 数据分析(参考)1 应用GCOS软件进行数据分析。2 Scaling方法：将芯片所有探针组的Signal从小到大排序，去掉最

17、大的2和最小的2后，将剩下探针组的平均信号值调整到500。常 用 试 剂 配 制1 电泳试剂1) 10x FA gel bufferMOPS 41.9 gNaAc 6.8 gEDTA(0.5M, pH 8.0) 20 mlNaOH调PH7.0，RNase free H2O调至 1000 ml2) 1 X FA gel running buffer (500ml) 10x FA gel buffer 50 ml 37%甲醛（formaldehyde） 10 ml RNase free H2O 440 ml3） 5X loading buffer (10 ml)溴酚兰 25 mgEDTA (0.5

18、M, pH 8.0) 80 ul37%甲醛（12.5M） 750 ul甘油 2 ml甲酰氨 (formamide) 3.084 ml10x FA gel buffer 4 ml4)电泳槽冲洗液NaOH 2 g0.5 M EDTA 1 mlDI H2O 500 ml5）Gel： 琼脂糖 1.2 g 10x FA gel buffer 10 ml DEPC水 至 100ml 凉后加入 甲醛溶液 1800 ul2 杂交试剂1）Wash Buffer A: Non-Stringent Wash Buffer(6X SSPE, 0.01% Tween-20)For 1,000 mL:300 mL of

19、20X SSPE1.0 mL of 10% Tween-20699 mL of waterFilter through a 0.2 m filter2）Wash Buffer B: Stringent Wash Buffer(100 mM MES, 0.1M Na+, 0.01% Tween-20)For 1,000 mL:83.3 mL of 12X MES Stock Buffer (see Section 2, Chapter 2 for reagent preparation)5.2 mL of 5M NaCl1.0 mL of 10% Tween-20910.5 mL of wate

20、rFilter through a 0.2 m filterStore at 2C to 8C and shield from light3）2X Stain Buffer(Final 1X concentration: 100 mM MES, 1M Na+, 0.05% Tween-20)For 250 mL:41.7 mL of 12X MES Stock Buffer92.5 mL of 5M NaCl2.5 mL of 10% Tween-20113.3 mL of waterFilter through a 0.2 m filterStore at 2C to 8C and shield from light4） 10 mg/mL Goat IgG StockResuspend 50 mg in 5 mL of 150 mM NaClStore at 4CIf a larger volume of the 10 mg/mL IgG stock is prepared, aliquot and store at -20Cuntil use. After the solut