亚细胞核的分离和鉴定

1、亚细胞核的分离和鉴定关键词：细胞 试剂 试剂盒 甲苯胺蓝 试剂 标准物质 北京标准物质网1、细胞核的分离 细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。细胞核的分离目前较常采用以蔗糖为介质的差速离心法，可分为细胞核分离和纯化两大步骤。细胞匀浆后，先以0. 25molL。的蔗糖1000g离心洗涤，然后在0. 34molL和088molL的蔗糖梯度中1500g离心1520分钟，沉

2、淀即为纯化的细胞核。现在细胞核的提取试剂已商业化生产，公司试剂盒中会提供详细的操作步骤。细胞核被分离后，可经甲苯胺蓝染色在光学显微镜下观察，或直接在电子显微镜下观察核内染色质的分布情况。2、细胞核的鉴定(1)光镜直接观察：普通光学显微镜下，贴壁细胞的细胞核为位于细胞中央的一团较深物质，悬浮细胞会显得更模糊，且都无法清晰分辨细胞核与细胞质。常用于细胞核的化学染料包括甲紫、苏木精、醋酸洋红、甲基绿等。苏木精伊红染色简称HE染色，是组织学、胚胎学和病理学最常用最基本的细胞核细胞质染色方法，细胞核嗜碱被苏木精染成蓝色(图5-3-1)。(2)电镜观察：电镜能清晰地观察到细胞核基质的基本形态，以及核膜、核

3、仁、核染色质等，所以可以被应用到细胞核的可视化研究中。比如细胞凋亡，电镜下清晰可见，核基质由结构完整到出现紊乱，到凋亡小体的形成并由核内排出。因此，电镜扫描可以清晰展示出细胞核的各个阶段的状态，能更形象化地应用于细胞核功能学、发育学以及细胞凋亡等研究中(图5-3-2)。(3)细胞学鉴定：核酸荧光染色后，可采用荧光显微镜、共聚焦激光扫描荧光显微镜以及流式细胞仪检测。常用的三大经典核酸染料包括：插入性染料，如：ethidium bromide(EB)和propidiumiodide(PI)；DNA小沟结台染料，如：DAPI和Hoechst：以及其他类核酸染料，如：吖啶橙、7-AAD、LDS751等

4、。DAPI是一种具有膜通透性的强力DNA荧光染料，可用于活细胞以及死细胞的细胞核染色。荧光显微镜下，DAPI可被紫外光激发出蓝色荧光，其荧光激发光358nm以及发射光461nm。因为彼此的发射光很少重叠，DAPI通常与绿色荧光(如GFP)和红色荧光(如RFP)结合，三者被用于细胞的多重荧光染色(图5-3-3)。Hoechst染料常用的有Hoechst 33258和Hoechst 33342，其激发光和发射光与DAPI非常相似，都可用于活细胞和固定细胞的标记。DAPI和Hoechst染料是科研人员最常使用的用于细胞核标记的荧光染料。此外，在细胞增殖的研究中，人们常常将BrduEdu等底物掺入到增

5、殖的细胞核DNA链中，再通过荧光素标记Brdu/Edu，继而显色增殖细胞的细胞核。在细胞凋亡研究中，人们常采用TUNEL染色标记凋亡细胞的细胞核。由于三维重建等优点，共聚焦显微镜在细胞成像技术中的地位逐渐突出。：DAPI虽然常用，但是多数共聚焦显微镜没有紫外线波段的激发光，所以其他一系列更适用于共聚焦的核酸荧光染料被开发出来，比如TOTO系列，TO-PRO系列，SYTOX系列以及SYTO系列等。3、方法优缺点比较与选择 细胞核检测较少采用细胞免疫荧光或原位免疫组化的检测方法，而普遍采用荧光染料与核酸物质直接结合而显色。组织染色中，细胞核的常规光镜观察优先选择苏木精染色，简单方便，普通光镜就能得到胞质区别明显的组织切片图片，但分辨率差，常常仅限于低倍镜下观看，且细胞核轮廓不清晰，染色特异性差。在多重细胞荧光染色时，DAPI和Hoechst染色为核酸染色首选，活细胞以及固定后的细胞上都可以得到特异性的细胞核成像，且轮廓清晰，染色高效快捷，由紫外光激发，与其他常用激发波段的波长基本不重叠。但DAPI为半透膜染料，组织核酸标记并不理想，并且其紫外激发波段也不适用于所有共聚焦显微镜。TOTO和TO-PRO等系列的核酸荧光染料常常用于共聚焦显微镜细胞成像，并且远红外激发波段的染料更常见。远红