病毒滴度测定

1、.可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，

2、则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。TU为transducing units的缩写，中文为转导单位，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。第一天 细胞准备将生长状态良好的 293 T 细胞消化计数后稀释至 1100 000/mL，加入 96 孔板，100 L/孔，为每个病毒准备 10 个孔。放入 37，5% 二氧化碳培养箱中培养。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10 个稀释度。稀释方法如

3、下：每种病毒准备 10 个 1.5mL EP 管，每管加入 90 L 培养液，往第一个管中加入 10 L 病毒原液，混匀后，吸取 10 L 加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（100.00000001）。吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天 追加培养液在每个孔再加入 100 L 完全培养液，利于细胞的生长。第四天 观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为 X 和 Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y10）1000/2/X 孔的病毒液的含量（L）。定量 PCR 法病毒感染 1 天前，取 6 孔板接种 HOS 细

4、胞。每孔细胞为 5100 000 个。接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为 N。弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5 g/mL polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释 200 倍，也就是取 1 L 病毒加入到 199 L 的培养基中。在 3 个培养孔中分别加入 0.5 L，5 L 和 50 L 的稀释病毒。感染开始后 20 小时，除去培养上清，换为 500 L 含 DNaseI 的新鲜培养基。在 37 消化 15 分钟，这一步是要除去残余的质粒 DNA。然后换为 2 mL 正常的培养基，继续培养 48 小时。用 0.5 m

5、L 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在 37 放置 1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照 DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组 DNA 。每个样品管中加入 200 L 洗脱液洗下 DNA 。用 DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组 DNA 可以稳定保存在 -20 至少两个月。准备 PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管 ：Forward primer （100 pmol/mL）：0.1L nReverse primer （100 pmol/mL）：0.1L nProbe （100 pmol/mL)：0.1L n水：19.7 L nn = number

6、of reactions。例如：总反应数为 40，将 1 mL 2 TaqMan Universal PCR Master Mix，4 L forward primer，4 L reverse primer，4 L probe 和 788 L 水混和。震荡后放在冰上。2 TaqMan Master Mix：25 L n10RNaseP primer/probe mix：2.5 L n水：17.5 L nn = number of reactions。例如：总反应数为 40，将 1 mL 2 TaqMan Universal PCR Master Mix，100 L 10RNaseP prime

7、r/probe mix 和 700 L 水混和。震荡后放在冰上。在预冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 体系建立。从总管 中各取 45 L 加入到 A-D 各行的孔中，从总管 中各取 45 L 加入到 E-G 各行的孔中。分别取 5 L 质粒标准品和待测样品基因组DNA 加入到 A-D 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个孔加入 5 L 的水做为无模板对照（no-template control）。分别取 5 L 基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E-G 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个孔加入 5 L 的水做为无模板对照（no-template control）。

8、所使用定量 PCR 仪为 ABI PRISM 7000 定量系统。循环条件设定为：50 2 分钟，95 10 分钟，然后是 95 15 秒，60 1 分钟的 40 个循环。数据分析：测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度（integration units per mL，IU/mL）的计算公式如下：IU/mL= (C N D1000)/V其中：C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为 1100000）D = 病毒载体的稀释倍数 ；V = 加入的稀释病毒的体积数。96孔板病毒滴定实验方法总结一看了前面一个关于

9、病毒滴定方法的帖子,自己也做过不少次,所以想写出一点儿,算是个总结,希望能对各位有所帮助.这里我写2种方法,一种是在稀释好的病毒液里加细胞悬液.另一种是在长成单层的细胞上,加入已经稀释好的病毒液.这两种方法我都做过,效果各有长处.1.一个确定的地方是,所用细胞是贴壁生长,所以在维持液或者生长液中都不能加入胰酶,这一点和流感病毒病毒滴定测定有很大不同;2.稀释液配方:MEM(或DMEM)+1%双抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值确定,一般以加到pH7.0为主,可用pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%).另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定;3.细胞悬液为细胞+生长液(MEM+

10、10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3).在加细胞悬液的病毒滴定测定方法中,如果不加入细胞生长液,则细胞无法贴壁;方法一.在稀释好的病毒液中加入细胞悬液:1.一个确定的地方是,所用细胞是贴壁生长,所以在维持液或者生长液中都不能加入姨酶,这一天和流感病毒病毒滴定测定有很大不同;2.稀释液配方:MEM(或DMEM)+1%双抗+NaHCO3(加入量由所需要pH值确定,一般以加到pH7.0为主,可用pH试纸测定,NaHCO3的浓度为6%).另,MEM,或DMEM的选择由所培养的宿主细胞决定;3.细胞悬液为细胞+生长液:MEM+10%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3加细胞悬液

11、的病毒滴定测定方法中,如果不加入细胞生长液,则细胞无法贴壁;4.96孔板上做10倍稀释病毒,从10-1开始,一般做5-6个稀释度,即到10-5或10-6即可,每孔25微升,每个稀释度做4孔,或者8孔,一般做4孔即可;5.消化细胞,并用生长液反复吹打细胞,使细胞充分混允,放入双碟,用排枪将细胞悬液加入相应孔中,每孔100微升;6.细胞对照孔:125微升细胞悬液,不加病毒;7.关于96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量)

12、,培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;8.37oC, 5CO2培养7天左右,每天观察结果,从出现CPE的第一天开始记录,一般第7天可以计算病毒滴度;9.计算公式,比较复杂,明天再附上,这里介绍一个简单的计算TCID50的方法:由以上公式求得 0.6 加到僅高於 50感染率稀釋指數 ( 此例中為10-3 )得10-3.6即為病毒作10-3.6稀釋後每 0.1ml 含 1 TCIP50，亦即該病毒之力價為 10-3.6/0.1ml。这里

13、是以每个稀释度8孔为例,如果做的是4孔一个稀释度,则对应的换一下数字即可.(这里是转自别人的帖子,但是我用了之后觉得比那个很长的公式容易得多,所以推荐给大家)10.本方法的优点:不容易污染;缺点: .细胞生长周期长,出结果所需时间也长,一般要到第7天才能计算病毒滴度;. 病毒本身有毒性,所以对细胞的贴壁造成一定影响,这也是此法中细胞生长慢的原因之一;. 不容易控制细胞数量,需要经验,一旦细胞数量过多,则不到第7天细胞大量死亡,无法判断CPE;若细胞数量过少,则细胞无法正常生长,不能正常增殖,也是造成无法判断CPE的原因之一;还有另外一种方法,明天再写.如果有什么不恰当的地方,希望有经验的高手多多指教,希望大家能多多交流,谢谢!4.维持液,即病毒培养液