牛奶β-乳球蛋白茶多酚复合物

1、牛奶-乳球蛋白茶多酚复合物关键字牛奶， 茶， 多酚 ，-乳球蛋白，次级结构，红外光谱，CD光盘，荧光光谱，建模思想摘要牛奶中茶多酚的抗氧化能力的影响尚未完全认识。茶多酚和牛奶蛋白的混合物可以改变茶化合物的抗氧化能力和蛋白质的次级结构。本次研究是为了在分子水平上，采用红外光谱，CD和荧光光谱法以及分子建模测试含有茶多酚的-乳球蛋白，C，EC,ECG,EGCG的互相作用。多酚结合模式，结合常数和多酚络合物在-LG稳定性的影响和次级结构由此决定。结构分析表明，多酚结合-LG通过亲水性和疏水性作用与全部的结合常数 KC-LG = 2.2 (0.8) _ 103 M_1, KEC-LG = 3.2 (1

2、) _ 103 M_1, KECG-LG = 1.1(0.6) _ 104 M_1 nd KEGCG-LG = 1.3 (0.8) _ 104 M_1.每个蛋白分子结合的多酚数是1.1 (C), 0.9 (EC), 0.9 (ECG) nd 1.3 (EGCG).分子模拟展示的是几个氨基酸残基在附有扩展的氢键网络结构的多酚-蛋白质络合物的参与。多酚类物质的存在和-螺旋指导蛋白质结构的稳定性改变-LG构象。这些数据可以被用来解释茶化合物的抗氧化活性是被牛奶的添加量所影响的机制。1简介 -乳球蛋白（ - LG ） （计划1） ，是最丰富的蛋白质乳清（1克/升）和食品工业上的主要利润，这是由于它的营

3、养和功能上的价值。这种蛋白质的结构是众所周知的。在中性pH条件下，-LG是以单体和二聚体的混合物形式存在的，其中平衡比率取决于二聚体常量和蛋白质浓度的结合度。每个单体由162个氨基酸残基组成，分子量为18kD。-LG是一个由八个反平行的-stnds和一个位于-rrel表面外部的-螺旋组成的折叠成花萼状的小型球状蛋白。-LG对于亲水性和疏水性化合物展示出很强的亲和力，包括脂肪酸，磷脂和芳香族化合物。茶是世界上最流行的饮料之一。近年来，已经有很多关于加牛奶到茶中是否有益健康的说法。牛奶中茶多酚的抗氧化能力作用一直是争论的话题，牛奶中关于不同茶多酚的抗氧化活性的双重影响最近被报道。然而，被牛奶影响的

4、茶化合物的抗氧化活性的机理仍然未知。在最近的报道中，带有-,-酪蛋白的茶多酚的混合物被研究，这种蛋白质二级结构的相互作用的影响和茶多酚的抗氧化能力被确定。植物多酚类化合物与球状蛋白显示了强烈的相互作用，可以导致蛋白质展开。在解决方案中，如儿茶素中的茶多酚可以与牛奶形成不溶性复合物。多酚与蛋白质的亲和力程度是与其大小有关的，随着分子的型号而增加。较大的多酚类似在红茶中的那些很有可能与牛奶蛋白形成配合物。这种结合通过减少可利用羟基的数目可以影响儿茶素的电子给与能力。以往的研究表明了牛奶蛋白关于茶多酚抗氧化的影响，而并未解决多酚混合物中牛奶蛋白的稳定性和构象的影响。因此，牛奶蛋白和多酚之间的相互作用

5、的结构特征是在阐明多酚关于牛奶蛋白结构和茶化合物抗氧化活性的诱导影响的重大阶段。荧光猝灭被视为一种测量亲和力的技术。荧光猝灭是通过各种分子与猝灭分子的相互作用从荧光诱导作用的荧光量子产率的降低。因此，可以用色氨酸-61和色氨酸19在-LG上的内在色氨酸荧光技术猝火，作为一种研究多酚和-LG为了表征儿茶素-蛋白络合物的特性的相互作用的工具。我们现在列举出光谱分析和带有茶多酚儿茶素，儿茶素，表儿茶素没食子酸在水溶液的生理条件下使用蛋白浓度常数和各种多酚含量的-LG的相互作用的对接研究。结构分析有关儿茶素结合模式和儿茶素-蛋白络合物在-LG稳定性和次级结构的影响在此有报道。2材料和方法2.1 材料-

6、乳球白素（一个变体，纯度90%）和茶儿茶素从西格玛-阿尔德里奇公司购买然后用于提供原料。其他化学试剂均为试剂级并且使用时无需进一步净化2.2母液的制备 -乳球蛋白溶解在水溶液中（ 9毫克/毫升获得0.5毫米的蛋白质含量） ，含10毫米TRIS “ HCl缓冲（ pH值7.4 ） 。准备在TRIS “盐酸多酚2毫米，并稀释至TRIS “盐酸不同浓度（ 1，0.5和0.25毫米） 。这种蛋白质分光光度计使用浓度的测定17,600 M 1厘米1 （ MW = 18 KD）的消光系数280 nm处。2.3红外光谱测定红外光谱记录在红外光谱仪（尼可莱6700），配备硫酸盐探测器设备（DTGS）和使用硒化

7、锌窗口的溴化氢分束器。多酚溶液加入到带有持续搅拌保证形成均匀溶液并且达到多酚溶液浓度，0.125,0.25和0.5毫米并且附有最终蛋白浓度0.25毫米的蛋白质溶液。光谱室在-乳球蛋白在多酚溶液室温下孵化两小时后收集的，利用水和电影干涉积累了光谱范围4000 “600 cm - 1处与一个2厘米的1和100次的标称分辨率。 “差光谱 （蛋白质溶液+多酚的解决方案） （蛋白质溶液） ，使用水的组合模式产生约2300 cm - 1处，作为标准（ Dousseu ， Therrien ， Pezolet1989年）。生产差光谱时，这个频段调整基线水平，以正常化差光谱。2.4蛋白质构成分析 关于 -乳球

8、蛋白的二级结构和它的多酚复合物的分析是在已经报道过的程序(yler & Susi, 1986)的基础上提出的。蛋白质的二级结构是由I带酰胺的形状确定的，位于16601650 cm。红外光谱是平滑的，并且他们的基准是使用内置的分光光度计(OMNIC ver. 7.3)软件自动矫正的，因此每频谱噪声的均方根是用在光谱区域17201575 cm的二阶导数这种方式计算的。 -乳球蛋白和复合物的五个主要峰解决了。以上光谱区是用曲线拟合方法，采用Levenerg- Mrqudt算法卷积的，并且，对应-螺旋峰(16571651 cm)， -表(16341608 cm),转(16701667 cm)和 -反平

9、行(16911686 cm)的峰也被调整了，同时面积是用高斯函数测量的。分配到给定构像的所有的组件带面积随后被概括并被总面积除。曲线拟合分析是使用银河工业公司的克/ I版7.01 软件进行的。2.5圆二色谱 -乳球蛋白和多酚复合物的CD光谱是由Jsco J-720 spectropolrimeter记录的，对于在远紫外区（178-260纳米）的测量，各路径长度为0.01厘米的石英细胞在氮气中被使用。对于每个不同多酚浓度（0.125，0.25和0.5毫米），蛋白质浓度保持恒定（12.5 LM）。以扫描速度为每分钟50纳米的五次扫描的累加起到了作用并且从260至180纳米的每个纳米的数据都被收集起

10、来。使用连接到水套的石英比色皿的NESL RTE- 111循环水浴，能够使样品温度保持在25 C。光谱用缓冲信号矫正并且分子CD（德）转换用JSCO标准分析软件操作。蛋白质二级结构的计算使用CDSSTR，它是通过同CD光谱比较来计算二级结构的不同分配的，它的测量是使用提供高品质的X -射线衍射数据的不同的蛋白质(Johnson, 1999; Sreerm & Woddy, 2000)。CDSSTR程序可由网站/sreerm/CDPro上的软件包提供。2.6荧光光谱 荧光实验是在Perkin - Elmer S55光谱仪上展开的。多酚1毫米的储存溶液需

11、要在室温(24 1 _C)的条件下进行准备，多酚（20鈥LM）的各种溶液要用以上的同样是在室温下连续稀释的储存溶液来准备。在10毫米的Tris - HCl（pH值7.4）下的 -乳球蛋白（200 LV）的溶液也要在室温（24 1 _C）下进行准备。以上的溶液先保留到以后使用。包含0.4毫升上面的蛋白质溶液的样本和各种多酚溶液混合以得到最终多酚浓度为10-200 LV的常数 - LG含量为100 LV的溶液。荧光光谱是在kexc=280 nm和凯米从290到500 nm下被记录的。根据以往的文献报道，要在340 nm（色氨酸）的强度来计算的结合常数（K）。(i et l., 2004; Dufo

12、ur & Dngles, 2005; Heet l., 2005; Tng, Qi, & Chen, 2005).2.7对接研究 对接研究是用rgusL4.0.1软件进行操作的(Mrk . Thompson, Plnri Softwre LLC, Settle, W,). - LG结构是从文献(Qin et l., 1998)中获得的并且多酚的三维结构产生于使用Chem3D超6.0的PM3半经验计算。整个蛋白质被选中作为一个潜在的结合位点，这是因为没有事先了解的此类位点可以利用。对接运行是在使用定期精度最高的1000候选人构成的阿古斯坞对接发动机上运行的。

13、构象使用华擎打分函数进行了排名，它估计了自由结合能量。在潜在结合位点的位置上，使用一个陡峭的体面对停靠的复杂构型进行优化，直到收敛算法，最多20次迭代为止。氨基酸残基在相对多酚3.5的距离内参与络合3.结果和讨论3.1多酚-LG络合物的红外光谱多酚- -乳球蛋白络合以红外光谱和它的衍生方法为特征。由于没有主要光谱在多酚的相互作用后在1660 cm (minly CO stretch)的蛋白质酰胺I带的和在1530 cm(CN stretching coupled with NH ending modes)(euchemin et l., 2007; Krimm & ndekr, 1986)的酰

14、胺II带转移，得到差光谱（蛋白质溶液+多酚的溶液）_（蛋白质溶液），以监测这些振动强度的变化，结果如图Fig. 1。同样地，由二阶导数的分辨率增强和曲线拟合程序(yler & Susi, 1986)而来的红外自去卷积，用于确定蛋白质二级结构中存在的茶多酚(Fig. 2 nd Tle 1)。 在低浓度茶多酚(0.125 mM),强度的增加被用于观察在1660cm 处的蛋白质酰胺I和1530 cm 处的酰胺II，即多酚鈥揵 - LG复合物的差光谱(Fig. 1, diffs., 0.125 mM)。积极的特点是位于在多酚- - LG电子复合物在1661,1516 (C-LG), 1650, 151

15、4 (EC-LG), 1631, 1536 (ECG-LG)和在1630, 1538 cm (EGCG-LG)时的酰胺I和II频段的差异谱。同样，在多酚 - 蛋白质复合物的差异谱中在16281608 cm时的积极的广泛的功能，来自于在1628 cm时与蛋白表组件(Fig. 1, diff., 0.125 mM)有关带的强度的大幅增加。这些积极的功能与经多酚 - 蛋白质络合酰胺I带和酰胺II带强度的增加有关。酰胺I带和酰胺II带强度的增加是由于由于多酚结合蛋白质C O，C- N和N - H组(hydrophilic interction)。除此之外的证据来支持C-N,N-H组多酚相互作用来自于蛋

16、白质酰胺带在3300厘米分之一的转换。在-LG 3290-3280厘米分之一自由基下，在多酚相互作用下。由于多酚浓度增加至0.5mm，增加蛋白质酰胺的强度，我观察酰胺II带在差光谱中的积极功能酰胺I和II频段在1665，1513（C - - LG），1654，1515（EC- 1 - LG），1630，1540（心电图， - LG），并在厘米（EGCG - LG）后多酚络合“（图1，差异，0.5MM）。 “在光谱的酰胺I带的强度进一步增加建议多酚- - LG电子的复合物增加亲蛋白 -螺旋和 -板结构，浓度高的多酚trtions。类似的红外光谱变化对蛋白质的观察在几个配体 - 蛋白质复合物，其中

17、主要的酰胺I带蛋白质构象发生变化（艾哈迈德Oumeur等，2006）。一个蛋白质二级结构的定量分析 自由的 - LG和多酚加合物水合 进行，结果如图。 2和表1。 - LG具有重大的 -片状含量51（1633，1618）， - helix11 12（1653厘米），关闭19（1668厘米）和 -反平行的231 （1687厘米）（图2和表1）。这些数据是一致的 以前 - LG光谱研究报告（QL等。 1997年）。多酚的互动，大幅增加的 -表后 观察和轻微增加了一个螺旋，后多酚 - LG络合（见表1）。构象变化O - 服务是ECG和EGCG明显比C和EC 复合物（Thisisindictiveof

18、lrgerpertur Fig.2ndTle1）。 蛋白质二级结构的tions lrgernd力量polyphe nols。这也是一致的，额外的稳定性后， - LG 多酚的相互作用 3.2。 CD光谱 CD光谱也可用于分析蛋白质的构象 mtion的多酚- - LG电子的复合物和结果 表2所示。裁谈会的结果表现出显着的相似之处 这些红外线数据（见表2）。蛋白质构象 基于光盘的数据分析表明，自由的 - LG有一个螺旋 12，表 - 50，关闭12和26（见表2），consis无规卷曲 帐篷与文献的报告（梁，Tjmir Rihi，Suirde， 2008; QL等，1997）。多酚的互动，增加后 从

19、50（游离蛋白）54-57的 -表和一个螺旋，从 12（游离蛋白）13-14，在多酚 - LG复合 （见表2）。增加的 -螺旋和 -表结构 伴随着从26减少到19无规卷曲 - 14后，多酚络合（见表2）。在增加的 - 表内容和螺旋和无规卷曲减少印度 在茶叶存在的蛋白质结构稳定tive聚 酚类，这是符合我们的红外分析（表1 和2）。窗体顶端3.3。疏水相互作用蛋白质CH2的反对称和光谱的变化在3000-1地区的对称伸缩振动2800厘米监测，以便找到存在hydrophoiccontctinthepolyphenol- - lctogloulincomplexes。免费的 -乳球蛋白的CH2乐队在2

20、945，2917，2895 nd厘米shiftedto2946，2912nd2897cm（C - - LG），to2943，12915，2893和2835厘米（EC- - LG），2946，2919，2897 nd112835厘米（心电图， - LG），2947，2919，2897和2835厘米图5。情节的日志功能多酚计算的日志（F0F）/ F（EGCG- - LG），后多酚络合（图3）。具有约束力的转移数（n）在多酚- - LG复合物。蛋白质反对称和对称收缩振动中CH2的转移，表明疏水相互作用通过聚苯酚环和疏水包在-LG电子上存在的，这与接下来讨论的荧光光谱结果是一致的。3.4荧光光谱和多酚

21、-酪蛋白的稳定性 -乳球蛋白有两个TRP - 19和色氨酸，色氨酸残基61。 TRP - 19是在非极性的环境，并有助于80总荧光，而TRP - 61是部分暴露在水溶剂色氨酸荧光（梁等有轻微的贡献。2008年）。当其他分子的相互作用与 - LG ，色氨酸荧光可能会改变取决于这种互动的影响蛋白质的构象（ Lkowicz ，1999;等。 Tyeh 2009年） 。在假设有实质性的结合位点（N）（二），蛋白（ Q）的淬淬火反应可如下：nQ t () Qn结合常数K，可以计算为：这里，Q和分别是粗灭剂和蛋白浓度，Qn是非荧光荧光猝火复合物的浓度并且给予了全部的蛋白浓度：荧光浓度和蛋白浓度成正比的，描

22、述为：原因是荧光测量可以被用来估计多酚蛋白复合物的结合常数合适的荧光分数可以通过修改STEM-VOLMER方程计算在这里，F0是最初的荧光强度，F是猝火剂中的荧光强度。钾是方程的猝灭常数，Q是猝火剂的摩尔浓度，f是可用荧光到极猝火剂的分数，表明了总排放量对于使用疏水剂的相互作用的荧光贡献分数。F0/ （F0- F)与1的结果是产量为1的拦截轴和（fk）1斜坡的比。因此，协调的比例和边坡给出了K。减少了荧光强度的-lg是监测在340纳米的多酚-lg系统（图4D代表结果为每个系统）。F0/ （F0- F)与1的结果多酚（ 图40是显示代表地块）如图4所示。假设从多酚类物质和蛋白质之间的相互作用来观

23、察荧光的变化，淬火可常被作为结合常数的复杂形式。在多酚-lg系统中，给出K值平均为three-replicte，每个运行涉及几个不同浓度的多酚。KC-LG = 2.2(0.8) 103 M1, KEC-LG = 3.2 (1) 103 M1, KECG-LG = 1.1(0.6) 104 M1 nd KEGCG-LG = 1.3 (0.8) 104 M(图 40D0表 3). 结合常数计算的多酚-lg表明低亲和力多酚与-lg互动，比对其他强大的配体蛋白复杂。(Krgh-Hnsen,1990; Krtochwil, Huer, Muller, Knsy, & Gerer, 2002; Nsouk

24、po-Kossi et l., 2007)。然而，类似的结合常数（103104 M-1）也报告了几个配体蛋白质复合物用荧光光谱的方法(i et l., 2004; Ling et l., 2008; Sulkowsk, 2002)。结合常数较大的多酚-lg复合体比那些较小的多酚-lg复合体大，这可能是由于存在更多的OH集团和大分子的多酚。 多酚约束每个蛋白质的量的计算是从表(F0 F)/F = logKS + n log【多酚】的静态淬火中得出的。(Chronneu & Tjmir-Rihi, 2010; Froehlich,Jennings, Sedght-Herti, & Tjmir-Ri

25、hi, 2009; Jing, Go, & He,2002; Jing et l., 2004; Ling et l., 2008; Mndeville &Tjmir-Rihi, 2010)。从图五的直线斜率的得出的值是-lg多酚复合物1.1 1.1 (C), 0.9 (EC),0.90 (ECG), 1.3 (EGCG)（图5，表3）。包含多酚-lg复合物的F值显示茶多酚与荧光可通过疏水性和亲水性相互作用。因此，我们预测，多酚结合的荧光主要位于内-lg。这争论是基于事实的trp-214排放系数（白蛋白）和trp-212（牛血清白蛋白）是340纳米，这是发射区隐色氨酸分子，而由于溶剂弛豫荧光发射暴露色氨酸分子是在更高的波长（350nm）(ourss, Knkis, Trntilis,Polissiou, & Tjmir-Rihi, 2010; Ling et l., 2008; Sulkowsk,2002; Tyeh et l., 2009)。紧缩的蛋白质结构通过分子的相互作用，如氢键在更疏水环境中可隐藏色氨酸。色氨酸的荧光强度的变化在-lg在中存在的多酚表现出不同模式。在茶多酚里，儿茶素、表儿茶素没食子酸配合发射带的自由蛋白质在340纳米（-lg）转为较低的波长为335纳米（图4C），而儿茶素复合体观察它更高的波长