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文档简介
1、PCR的一般流程(以Taq DNA聚合酶为例)一、 试剂和仪器1、仪器:PCR仪、移液器、离心管和枪头(121灭菌20min,烘干)、冰盒、板架、离心机。2.ddH2O:三蒸水121灭菌20min,4保存;3.Buffer:含Mg2+,10,-20保存;4.dNTP:保存液为25mM,使用前用ddH2O稀释为2.5mM并分装,避免污染,-20保存。5.引物:引物干粉在溶解前先12,000rpm离心2min,再用ddH2O溶解至10M,涡旋震荡使其充分溶解,-20保存;6.模板。7.Taq DNA聚合酶:-20保存。二、 实验准备1.预订PCR仪,填写好使用时间;2.制冰;3.将所需试剂解冻、混
2、匀、瞬离,置于冰上,模板要放在冰上解冻。三、 步骤:1.设计实验,认真阅读相关试剂说明书。2.将离心管置于冰上,按照如下体系加入样品。加样顺序为:ddH2OBuffer/dNTP/引物/模板。Taq DNA聚合酶反应体系(25L)试剂用量(L)ddH2O18.375LBuffer (Mg2+,10)2.5LdNTP(2.5mM)2L引物(正向和反向,10M)各0.5L模板DNA102105copiesTaq DNA聚合酶*0.125L* 注意:加酶之前将酶拿出放冰上,使用完立即放回冰箱。3.在离心管盖上写好每个样品的编号,瞬离。4.设置好PCR程序,待反应温度达到实验需要时,将样品放入PCR仪
3、,尽量放在中央的孔。5.将试剂放回原处,移液器调回最大量程,整理实验台。6.反应结束后,及时停止PCR程序(不要停在4太久),取出样品,关好PCR仪。四、 其它注意事项:1.正确使用移液器、离心机和PCR仪;2.手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、管的内壁、盖内侧;3.不使用枪头时,盖好枪头盒盖;4.枪头只能使用一次;5.合理设计实验,使用适当的阴性对照很重要,如:使用不加DNA的材料进行PCR扩增,以证明缓冲液或其他试剂中是否存在任何可影响PCR的污染物;6.如果一次实验需做多管样品,尽量先配制mix,由于存在液体混合后的体积变化和挂液,计算mix用量要比实际管数多一些;7.反应在PCR仪进行
4、期间,最好能检查一下程序是否在正常运行,及时发现异常。3.2 移液器的使用方法1.调节量程:轻轻旋转量程调节圈,注意不要超过量程。建议从高到低调节量程,必要时,可旋转量程调节圈稍超过所需数值,再向回旋转,移液可以更准确。2.装配枪头:轻轻按压,将枪头盒上的枪头装配到移液器。3.吸液:按下操作键至一档(设定体积),将枪头垂直浸入液体约4mm;让操作键慢慢复位,此过程中保持枪头浸入深度,防止吸入空气;将枪头慢慢移出液面,并确保枪头外壁无残留液体。(建议每个新枪头先经过一到三次的吸液和放液来润湿,有助于提高移液准确度。吸取大体积液体时,将枪头保持浸入状态约3秒钟,再移液。)A B图3.2.1 移液器
5、的吸液(A)和放液(B)4.放液:将枪头倾斜地紧贴管壁,将操作键慢慢按向一档(设定体积),等待,直到不再有液体流出;将操作键按向二档(吹液),将枪头完全排空;仍然按住操作键,在管壁上擦拭枪头;在管外,慢慢让操作键复位;按下脱卸键卸掉枪头。5.其它注意事项:(1)轻拿轻放,使用后调回最大量程;(2)保持移液器洁净。(3)与水有很大物理性差异的溶液,或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液,可能会导致移液不准,要注意检查移液体积。3.3 PCR反应原理及过程3.3.1 反应原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,是利用DNA在体外摄氏95高
6、温时变性会变成单链,低温(经常是60C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链(图3.3.1)。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。3.5.2 反应过程PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成(图3.3.2):模板DNA的变性:模板DNA经加热至95左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链
7、后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。图3.3.1 PCR反应原理图3.3.2 PCR的基本步骤3.4 几种常用PCR方法3.4.1 标准PCR(Standard PCR)该方法适用于扩增小于3000bp的DNA序列。建议体系:
8、Reaction Volume100LTaq Polymerase2-2.5UPrimers0.1-1.0M eachdNTP0.2mM eachSalt6-50mM KCl or (NH4)2SO4Mg2+1.5-5.0mM MgCl2 or MgSO4BufferTris-HCl 10-50mM, pH 7.5-9.0Template102-105copies3.4.2 长范围PCR(Long and Accurate PCR,LA PCR)使用混合的聚合酶(含有一种能校对的聚合酶)能够增加可扩增产物的大小(5kb 40kb),因为能去掉错误掺入的核苷酸,而不引起链的终止。Reaction
9、 Volume33LPolymerase Klentaq1 (a) plus 1/16 Pfu or 1/50 Deep Vent (by volume; 1/160 or 1/500 by units)Salt16mM (NH4)2SO4, no KClMg2+3.5mM MgCl2pH9.2Buffer50mM TrisTemplate2ng lambda DNACycles20Extension Temp68Extension Time11-24min (longer at later cycles)3.4.3 热启动PCR(Hot Start PCR)热启动PCR是提高产量和特异性的一
10、种简单方法,但也可能会造成重复性和污染等问题。室温下加样,可能会导致引物和模板的非特异性结合。在PCR的最初几个循环里,通过变性可以防止这些非特异性结合产物的延伸。热启动PCR则通过控制一种PCR成分的加样时间,来提高扩增的特异性。通常,直到反应温度到达引物最适退火温度以上时,再加入这种关键成分,如引物、酶、Mg2+或dNTP。热启动温度随推迟反应的方式而改变。推迟PCR反应有几种方式。最简单的一种是,在反应管达到第一个循环的DNA熔解温度之前,不要将DNA聚合酶加到反应管内。当处理少量样品时,这种方法可以得到令人满意的效果;但当处理大量样品时,则效果不佳。一种更方便的方法是,使一种组分在达到
11、一个适当的温度之前处于无效状态。例如,把聚合酶或镁盐掺入到蜡珠内便可做到这一点,这些珠子在适当的温度熔化,能够使反应开始。另一种方法是,在开始时,用一种抗体与聚合酶形成复合物,使聚合酶灭活,在高温下抗体变性,能够使聚合酶发挥功能。如果在热启动PCR中使用修饰过的酶,则需要向典型的PCR反应中加一预热步骤,预热温度可以在92-100之间,时间为2-20分钟,有助于消除在较低温度时引物和模板结合形成的非特异产物。热启动PCR可以与其它PCR方法(如touchdown PCR)结合使用。3.4.4温度递降PCR(Touchdown PCR)Touchdown PCR最初用来简化确定最适退火温度的过程
12、。最初使用一个高的退火温度(在此温度下,即使正确的结合可能也无法进行),在随后几轮,降低退火温度,当降到某一个温度点时,只有正确匹配的引物-模板能够退火,而不正确的匹配则不能够退火,因此DNA合成能够开始。尽管后来的循环可能会在不是最严谨的条件下进行,但早期的循环已在最严谨的条件下进行,想要的目标产物将是最丰富的。通常,第一个循环的退火温度设置为高于理论Tm 15,在接下来的循环里,每循环降低1-2,直到低于Tm 5左右。3.4.5 嵌套PCR(巢式PCR,Nested PCR)在这种PCR中,进行两次连续的PCR。第一次PCR使用常规的模板,然后用第一次PCR反应的产物(通常要稀释适当倍数)
13、作为第二次PCR的模板,将第二次PCR的引物设计成能够与第一次PCR目标产物的序列退火。虽然第一次PCR除了能产生目标产物外,可能还会产生一些非特异性的产物,但非特异性的产物几乎不可能也包含第二次PCR所用引物的两个位点。因此,只有第一次PCR的目标产物才可能是第二次PCR的合适模板。3.5 PCR可变因素PCR的各种因素相互影响,相互制约,很难同时提高PCR的特异性、产量和保真度。3.5.1 引物(Primers)标准用量:0.1-1.0M。多数情况下,0.2-0.5M就能满足需要。提高特异性:1、降低引物和dNTP的浓度可以显著提高特异性。高浓度会导致非特异结合、引物二聚体的形成。2、在适
14、当范围内,降低引物/模板的比例。提高产量:提高引物/模板的比例。如果有过剩的引物,需要降低引物浓度。3.5.2 聚合酶(Polymerases)标准用量:1-5Units/L。(不同供货商对“Unit”的定义会有差别。)提高特异性:在适当范围内,降低聚合酶浓度。聚合酶浓度是决定PCR严格度的一个关键因素。高浓度的聚合酶不仅会降低特异性,还会造成不必要的浪费。提高保真度:使用高保真聚合酶。3.5.3 模板(Templates)标准用量:102-105个拷贝。反应中的模板量应当用目的序列的拷贝数来衡量。一般,降低DNA模板浓度,也应该降低聚合酶浓度(在合适范围内)。提高特异性:1、增加模板量。2、
15、降低引物/模板的比例。提高产量:1、增加引物/模板比例。2、扩增较小片段的模板DNA,更易获得较高产量。3.5.4 dNTP(Deoxynucleoside Triphosphates)标准用量:20-200M。四种dNTP的浓度应当相同,并且要高于每种dNTP的估算Km(10M-15M)。提高特异性:降低dNTP浓度。需要注意的是,Mg2+的浓度也要等摩尔比例地降低。提高产量:对于较长的模板序列,要适当增加dNTP。提高保真度:降低dNTP浓度。3.5.5镁离子(Magnesium ions)Mg2+浓度应当比总dNTP浓度多0.5-3.0mM。提高特异性:降低浓度。注意如果Mg2+浓度不正
16、确会降低产量。提高产量:提高浓度。然而,Mg2+浓度过高易导致非特异性结合和电泳smear。3.5.6预温育的温度和时间(Preincubation Temperatures and Times)标准范围:92-96,30sec-10min。预温育能降低样品中有害蛋白酶和核酸酶的活性,还能保证基因组DNA中复杂模板完全变性。3.5.7解链温度和时间(Melting Temperatures and Times)标准范围:68-75,30-120sec。通常将加热变性使50%的双链DNA解链的温度称为DNA的解链温度或熔解温度,用Tm表示。影响解链温度的因素是样品的总质量和浓度。有一些方法可以计
17、算解链温度,但只是估计,实验所需的最优温度还需要结合经验来尝试。时间方面则需要考虑PCR仪的升温降温过程,以及PCR仪是根据样品温度来计算时间,还是仅根据仪器孔的温度来计算时间。对于20bp的引物,Tm=62.3+0.41(%G-C)-500/length。3.5.8退火(Annealing/Hybridization)标准范围:37-65(一般是比Tm低5),10-120sec。LA PCR的退火时间可以估算为:60sec+(2.5sec/100bp)。提高特异性:1、提高退火温度(2-5)可以降低非特异匹配的几率。2、缩短退火时间,因为过长的退火时间通常不会提高产量,反而会增加错误匹配的几
18、率。3.5.9延伸(Extension/Polymerization)标准范围:72,60-120sec。通常使用的DNA聚合酶的延伸速率是每秒50个核苷酸,因此如果PCR产物不超过400bp,最好将延伸时间控制在15秒以内。较长的PCR产物需要相应较长的延伸时间。LA PCR延伸时间可以估算为:60sec+(2.5sec/100bp)。3.5.10循环数(Cycles)标准范围:25-50个循环。通常,每个PCR循环包括变性、退火和延伸三步。但根据聚合酶和PCR仪的不同,三步有时可以减至两步。在一定循环数内,PCR产量与循环数成指数关系,但由于平台效应的存在,增加循环数不一定会提高产量和特异性。提高特异性:1、减少循环数,2、缩短
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