实验九食品中蛋白质含量的测定lyd

1、实验十二 食品中蛋白质含量的测定（一）微量凯氏定氮法 李亚东 一、 实验原理蛋白质是复杂的含氮有机物，主要是由碳、氢、氧、氮、硫五种元素组成，由20种氨基酸通过酰胺键（肽键）以一定的方式结合而成。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含量也不同，蛋白质中的氮含量一般为15-17.6%，按16%计算，氮换算为蛋白质的系数为6.25。如玉米、荞麦、青豆、高粱、鸡蛋、肉及肉制品为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其制品为5.71；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。在食品和生物材料中，还包括有非蛋白质氮的化合

2、物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、啉和含氮色素等。因此，凯氏定氮法测定蛋白质含量的同时，还包括非蛋白质的含氮部分，故结果称为粗蛋白质含量。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的有机氮与硫酸结合生成硫酸铵。然后，碱化蒸馏使胺游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数，即为蛋白质含量。称为凯氏定氮法，由于1833年首先提出，经长期改进已演变为常量法、微量法、自动定氮仪法及改良式微量凯氏法等多种。本法是测定食品中蛋白质的标准方法。 消化NH2(CH2)COOH+H2SO4 NH2(CH2)OH+H2O+SO2NH2(CH2)OH+2H2

3、SO4 NH3+CO2+2SO4+3H2O2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏(NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O 滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O 2NH4Cl+4H3BO3或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3二、实验试剂所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。1 混合催化剂:硫酸铜10g，硫酸钾100g，硒粉0.2g，在碾钵中碾细，过40目筛。2 标准硫酸氨溶液:准确称取重结晶的硫酸铵1.414g，溶解并定容为1000mL。3 浓硫酸4硼酸溶液（2%）

4、:临用前取100mL，滴加约1mL混合指示剂，摇匀后，溶液应该呈酒红色。5氢氧化钠溶液（40%）6 混合指示剂:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合均匀。7 0.01mol/L盐酸标准溶液（需要标定）三、仪器1 （改良式）微量凯氏定氮仪2 凯氏烧瓶 250mL3 酸式微量滴定管 10mL四、 操作方法（一）消化精密称取0.20.4g谷物样品，置于消化管中内，不能沾染瓶颈，加入0.5g混合催化剂及3mL硫酸，在放置于通风橱内的消化炉中小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后（该过程大约需要23小时），再继续加热0.

5、5h。取下放置冷却后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗凯氏烧瓶，洗掖并入容量瓶中，再加水至刻度，摇匀备用。同时做一空白实验。（二）仪器的安装和样品的蒸馏、吸收与滴定1、微量凯氏定氮仪（1）蒸馏的准备工作凯氏定氮仪的安装:按照图181所示顺序将微量凯氏定氮仪的各部件安装好。要求装得稳妥端正。各部件之间以乳胶管相连，不得漏气。吸收瓶的洗涤与检查:用作吸收瓶的三角瓶，一定要洗涤干净。先按一般方法洗净，再按图182的方法用蒸气洗涤数分钟，冷却后加入2硼酸指示剂混合液5o或10Omi。若瓶中液体呈紫红色(葡萄紫色)，用表面皿盖好瓶口备用。若瓶中液体变绿色，则说明吸收瓶没有洗净，需用蒸气重新洗涤后再用

6、。凯氏定氮仪的洗涤与检查:在烧瓶(蒸气发生器)内装半瓶蒸馏水，再加浓硫酸及混合指示剂各数滴将瓶中蒸馏水酸化。再加沸石少许。打开自由夹9关闭夹子11，12，冷凝管通进冷却水，然后将烧瓶内水煮沸，此时产生的蒸气可充分地洗涤仪器。约十分钟后，再换上吸收瓶。吸收瓶中加有lOmL硼酸指示剂混合液，将冷凝管的出口浸没在吸收瓶液面之下。继续冲洗23分钟，若吸收瓶内溶液的颜色不变，则表明该仪器被冲洗干净。然后先移去吸收瓶，关闭自由夹9，打开夹子12。此时，由于贮液瓶受到自然冷却，其内部形成负压，反应瓶内的废液，因受到从冷凝管出口传来的大气压力，而自动地流人贮液瓶中。贮液瓶中的废液，再经打开活塞11即可排出。另

7、外在进行冲洗时，还须同时检查仪器的各个连接部位，以免出现漏气现象。蒸馏操作练习:为了熟悉仪器的操作方法，用事先配制好的标准硫酸铵溶液代替样品消化液，反复进行蒸馏、滴定和计算，直至完全熟练，再正式蒸馏试样消化液。在夹子9关闭，12，11打开的情况下，用移液管准确量取5.0mL标准硫酸铵溶液，注入漏斗中。随即打开夹子10，使硫酸铵溶液流入反应瓶中。然后，每次用2mL水共3次冲洗漏斗，也全部放人反应瓶中。在冷凝管出口处放上已盛有10.0mL 2硼酸指示剂混合液的三角瓶，并使冷凝管出口浸没在吸收液中。用量筒取1012mL 40氢氧化钠溶液，注入漏斗中。打开夹子10，当碱液快流完时(留碱液约1mL)，立

8、即关闭夹子10。此时向漏斗中再注入约2mL水，起封闭作用，以防氨气逸出。上述操作依次完成后，即可打开夹子9，关闭夹子11、12。这时蒸气从烧瓶经过贮液瓶进入反应瓶中，瓶中所加的硫酸铵溶液受热后迅速与碱液起反应,从而有氨气放出。氨气与水蒸气一起通过定氮球进入冷凝管，最终以液滴形式进入吸收瓶，使吸收瓶硼酸液因吸收氨而变色。当吸收液从酒红色变为蓝绿色后，再继续蒸馏23分钟为蒸馏完全。这时将吸收瓶向下移，使液面离开冷凝管约1cm，然后用少量蒸馏水冲洗冷凝管出口，最后取下吸收瓶，用表面皿盖好瓶口，准备滴定。每完成一次蒸馏后，对反应瓶就要进行排废液和洗涤。为了保证测定的准确性，每次蒸馏之后，起码要冲洗3次

9、。滴定:用装有0010molL的标准盐酸溶液滴定上述吸收液，直至吸收液呈淡紫红色(淡葡萄紫色)并在半分钟内不褪色为止，记录消耗标准盐酸的体积(m1)。消化液的蒸馏、吸收及滴定:用完成的消化稀释液代替标准硫酸铵溶液依照上述的的操作方法，进行正式蒸馏、吸收和滴定操作。其方法与测定标准硫酸铵溶液时完全相同。2 熟悉改良式微量凯氏定氮仪。将自来水经(11)注入到蒸馏瓶夹层(1)中，使水面稍低于蒸馏瓶颈部的转弯处，把装有2%硼酸溶液的接受瓶,置于冷凝器(8)的下方，冷凝器的出口尖端（9）插入酸液面以下，接收瓶内须事先加入指示剂。将样品由漏斗（7）注入到蒸馏瓶（2）中，并以少量水冲洗漏斗，并把氢氧化钠溶液

10、由漏斗（7）注入到蒸馏瓶（2）中，并以少量的蒸馏水冲洗漏斗，然后用少量蒸馏水将漏斗封闭。最后加热，将蒸馏夹层（1）内的水煮沸，从蒸馏瓶（2）内的水溶液沸腾开始计算时间，大约5分钟即可蒸馏完毕，移开接收瓶后，再移去火源以防倒吸。接收瓶蒸馏瓶的洗涤:当把火源移去后，蒸馏瓶内的废液立即流到蒸馏瓶的夹层（1）中，用手按住（11）亦即可，并经排水管（14）排出。再把装有蒸馏水的三角瓶置于冷凝器尖端插入水的液面以下，再加热至沸腾，然后移去火源，三角瓶中蒸馏水流到蒸馏瓶（3）内，再倒流至蒸馏瓶的夹层（1）中，再由排水管（17）排出。按照上述方法将仪器洗涤2-3次。3 蒸馏向蒸馏瓶内加入10mL2%硼酸溶液及

11、混合指示剂1滴，溶液呈酒红色，使冷凝管（9）下端插入液面下。吸收5.0mL样品消化稀释液，由漏斗（7）入蒸馏瓶（2），并用少量水冲洗，再将10mL40%氢氧化钠溶液由漏斗入蒸馏瓶，以少量水洗涤，夹紧螺旋夹，用少量水将漏斗封闭，此时蒸馏瓶中内容物转为深兰色或产生褐色沉淀。开始蒸馏，蒸馏瓶夹层中水加热传导给蒸馏瓶（2）使氨挥发，沿着冷凝管（8）而入接收瓶，至硼酸接受液开始由酒红色变为蓝绿色时起，继续蒸馏约5min，将冷凝管尖端提出液面，再蒸馏1min，然后用水淋洗冷凝管尖端外部，取下接收瓶停止蒸馏。同时做试剂空白试验。4 滴定用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至溶液由蓝绿色转为微红色为终点，记录

12、滴定所用盐酸标准体积。五 反应式 消化NH2(CH2)COOH+H2SO4 NH2(CH2)OH+H2O+SO2NH2(CH2)OH+2H2SO4 NH3+CO2+2SO4+3H2O2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏(NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+Na2SO4+2H2O2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O 滴定(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O 2NH4Cl+4H3BO3或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3六 计算F100X= (V1-V2)mol/L0.014 W 5/100式中:X:样品中蛋白质的含量

13、，%；V1:样品消耗盐酸标准溶液的体积，mL;V2: 试剂空白消耗盐酸标准液体积，mL；mol/L: 盐酸标准液的摩尔浓度；0. 014: 1摩尔盐酸标准液1相当于氮数；W: 样品的质量，；F: 氮换算为蛋白质的系数；5/100: 稀释比。V1=6.31-1.86=4.45ml V2=0.4ml w=0.5020gX=15.24%分析：奶粉中蛋白质的含量在15%到20%之间，该奶粉是合格的，由于操作人员失误，未将冷凝器出口一直伸入接收瓶的液面下，导致另外一组数据偏小，因此，该组实验数据作废，有效数据只有第二组。六、说明1 称样时应注意，不要将试样沾在瓶颈上，固体样品用绘图纸包好投入凯氏烧瓶内，

14、同时空白试验也放入同样大小绘图纸。含水分多的样品或液体样品，应先将水分蒸发掉，然后进行消化。2 消化样品时，一般约3-4h左右，消化时间过长会引起损失，若样品含脂肪或糖多时，消化时间会适当长些，应注意防止泡沫溢出瓶外，须时时摇动，并减少火力，必要时可以停止加热30min后，再用大火消化。消化液澄清时应呈蓝绿色。3 硫酸钾的加入能提高消化液的沸点，加快样品分解速度，缩短消化时间，但硫酸钾与硫酸的用量比不宜过大，因温度过高生成的硫酸氢铵也会分解放出氨，造成氮的损失，使结果偏低。反应式如下:K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O+SO4但K2SO4加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。(NH4)2SO4=NH3+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O4 硫酸铜的催化作用机理如下反应式所示:2CuSO4 CuSO4+SO2+O2C+2CuSO4 Cu2SO4+SO4+CO2Cu2SO4+2H2SO4 2CuSO4+2H2O+SO2此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜褐色生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。5 蒸馏过程中不得停