样本采集与处理[谷风资料]

1、样本采集样本采集要注意的重点是，所采集的临床标本一定要正确和采集的时间合适，并注意采用正确的标本容器，采集的方法程序对有些临床标本非常重要。在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。尽可能在最短的时间内完成样本的采集（应该保证30min内完成，不适当的处理时间将直接影响和干扰研究的结果），应尽快降低所采集组织样本的温度。肿瘤组织标本的采集和处理应遵循严格的生物安全处理规范，也可根据研究者所提出的特殊要求，按照对方提供的操作模式进行相关处理。（1）患者入院后进行生物安全性检查。检测HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情况。HIV感染患者不列为采集对象。HBV及HCV感染者，须在

2、样本上明确注明。（3）组织标本取材时间 肿瘤外科手术后，标本离体30min内。（4）标本采集每种肿瘤主要采集3 类生物样本，并要保证这些样本的质量和数量能够用于DNA、RNA 和蛋白质提取及满足相关的实验分析。1) 新鲜组织(包括手术和活检组织)实体组织样本采集包括外科手术切除的或活检和尸检得到的正常、良性和恶性肿瘤组织。手术结束后，在临床肿瘤病理专家的指导下，在不影响病理诊断取材需要的前提下，采集组织样本。A。标本取材部位：肿瘤组织、癌旁组织（癌组织旁1cm）和正常组织（癌组织旁5cm以外或最远处）。a） 临床诊断明确，未经放疗和化疗的手术切除标本，在病理医生指导下取材。b） 尽量保证癌组织

3、没有坏死（有坏死的标本很难提取高质量的RNA 和蛋白）。c） 配对“癌旁组织”，选择距离癌灶边缘3 cm 范围内的组织样本，配对“正常组织”，要选择距癌灶边缘5 CM 以上或距离癌灶边缘最远段（或手术切缘处）取组织样本，应注明距离。对于空腔器官，如食管、胃、肠、胆囊、膀胱等，“癌旁组织”“正常组织”应取相应部位的“粘膜组织”样本。d） 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽量提供足量的肿瘤和癌旁正常组织，一般不少于200mg 或10E7 细胞。e）手术切除的组织样本必须迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80冰箱，这一过程尽量在手术标本离体后30 分钟内完成。f) 其中一块组织可用OCT 处理后

4、冻存，可用于形态学观察和显微切割。(OCT(Optimal Cutting Temperature)包埋剂是一种常用的固形剂。用其包埋组织进行速冻后，能与组织固定成形，有利于保存组织结构完整性，便于其形态结构的分析)B。过程：使用数码相机拍摄标本外观后，将标本切成小块（直径0.5cm0.5cm，厚度0.5cm），为减少处理时间，标本不应切得太小，然后放入冻存管中，标记后放入标本盒中，盒盖上附有记录标本编号、采集时间及标本类型的标签。每例病人样本保存3-5份冻存管标本。每份组织重量原则上不低于2g。2) 石蜡包埋组织a）中性福尔马林固定手术切除标本按病理学操作规范进行取材b）取材部位包括癌灶，以

5、及癌灶周围3cm 以内的癌旁组织，35cm 的近癌组织 和5cm以外的远癌组织或距癌灶边缘最远段分别取2-3 块。取材尽量以癌灶为中心水平向两侧取材，尽量保证足够大的组织样本。取材应该以“远癌-近癌-癌灶”的顺序。癌灶处取材包括癌与正常组织的交界及肿瘤浸润最深处。所有取材的组织块应标明取材部位。c）采集完整的临床病理和随访资料，其中治疗过程和生存期的资料最为关键。3）血液（包括血浆、血清）始终遵循标准防护方法，所有操作均要戴手套。在抽取静脉血时，应当使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和（或）培养管中。用完后自动废弃针头。每例不低于全血10

6、mL，分装两份。以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂的选择，一般使用EDTA-K3或枸橼酸钠，不可使用肝素。全血样本如用于DNA提取检测，可4下短期保存，如用于RNA检测，则应在取血后尽快提取RNA。a）及时采集入组病例的外周血标本,初诊患者3-5 ml，EDTA 抗凝，3000rpm 离心，血浆和有形成份(白细胞成分)分别用统一质量标准的容器保存（尽量在2h内完成血浆的分离工作）。b）特殊病例要保存治疗前后的外周血标本各5 ml (血浆或血清)。c）采集的血浆或血清样本在无菌条件下分装，0.5-1 mL/每管,用螺纹口管，-80保存。d）手术前后血浆或血清，明确临床诊断后在术前取血，术后第1

7、4天或出院前取血。e) 化疗前后血浆或血清采集按照临床试验操作规程和技术标准制定。f) 非癌患者/正常对照血浆或血清样本，选择年龄、性别与实验组相匹配的非癌患者为对象。2、根据研究课题的具体目标，所采集的生物样本主要用于3 类实验研究：1）测试样本：主要用于基因、蛋白表达谱建立，基因组测序分析，样本质量优先。主要考虑的因素为肿瘤分型和分类，每一类型要达到统计学小样本数目。2）验证样本：主要用于标志基因变异的确认，进行RT-PCR、WB、IHC/ISH、突变检测、ELISA 的实验分析。主要考虑的因素为肿瘤分型、分类和分期，包括不同阶段癌前病变组织样本，病理学诊断要明确，每一类型要保障统计学大样

8、本数目。3） 分型样本：主要用于肿瘤标志基因或蛋白的大样本、多中心临床验证，包括IHC，ELISA， REAL TIME RT/PCR，基因/蛋白临床检测芯片的分析。临床随访资料和生存期为考虑的主要因素，每一类型要保障符合多中心、大样本的统计学要求。采样及运输容器标本的采集材料如棉签、拭子等均应为一次性使用，采样所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、和血浆样本，首先要抗凝，抗凝剂的选择很重要。一般应使用EDTA和构橼酸盐作为抗凝剂，肝素因其对PCR扩增有很强的抑制作用，且在后面的核酸提取中很难去除，故应尽量避免使用。此外，标本运输中的保存液对其有稀释作用，

9、因此应考虑稀释对测定的影响。现已有厂商专门有用于PCR检测标本采集的无核酸酶容器供应。样本采集中的防污染样本采集最好采用一次性无菌及无核酸酶的材料，不用处理便可直接使用，采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等。如使用玻璃器皿，必须经0.1%DEPC水处理后高压，以使可能存在的RNase失活，并降解对PCR有抑制作用的DEPC。采样质量的评价血清（浆）标本可观察标本是否溶血、脂血及其程度，并明确这种情况是否会对相应的检测造成影响。总而言之，标本的收集及适当的预处理，对用于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有决定性作用。附件5 肿瘤样本采集的基本技术标准（适用于部分小量生物样

10、本提供单位使用）1. 所有入组病例要按要求采集肿瘤组织标本、血液和具有临床检测意义的体液。2. 送检肿瘤组织和血液标本最好在未经放疗和化疗前采集。3. 送检肿瘤标本必须病理诊断明确，尽量保证有足够多的癌细胞（50%以上为好）。4. 癌组织没有坏死。（有坏死的标本很难提取高质量的RNA 和蛋白）5. 在保障病理学检测所需标本的前提下，尽量提供足量的肿瘤标本和癌旁正常组织，至少1-2 克。6.手术标本必须迅速置于液氮中，然后保存于-80或-130冰箱，这一过程要求在手术离体后30 分钟内完成）。7. 如果不能提供与病理学检测平行的活检组织标本，至少提供 5-10 张组织切片。8. 要提供与病理学检

11、测平行的石腊组织块或福尔马林固定组织标本，或至少提供5-10张组织切片。9. 提供肿瘤脱落细胞涂片或组织印片 5-10 张10. 及时采集入组病例的外周血标本,初诊患者5-10 ml，EDTA 抗凝，3000rpm 离心，血浆和有形成份分别用统一质量标准的容器保存。特殊病例要保存治疗前后的外周血标本各5 ml (血浆)。附件8 （供参与国际合作的课题组参考）国际肿瘤基因组协作研究（ICGC）肿瘤组织样本质量标准三、样本质量标准及操作规范：1. 在ICGC 计划实施一开始，就应保证所采用的肿瘤类型和样本的高度均一性。2. 在ICGC 计划实施的一开始，应保证使用的肿瘤样本未经过任何治疗,即原发灶

12、，不要复发的肿瘤组织样本,解剖学上为单一起源，并能代表单一组织学类型或亚型，(最好为同一组织病理学级别)。3. 采用样本中的肿瘤细胞要在80%以上，坏死细胞或正常细胞(炎性细胞,免疫细胞,间质细胞或癌前病变细胞) 应少于20%。某些种类的肿瘤,可能需要适当降低以上标准,但是如果肿瘤细胞数低于60%时,就需要考虑利用一些物理的方法进行富集。4. 需要备有组织学鉴定的文档和图像资料,能够提供给从事特定肿瘤的研究者参考。要明确评估组织的等级1)坏死;2)碎片;3)炎性组织;4)纤维化;7. 原则上,每例样本需要200 mg 实体瘤组织或10E7 流式细胞仪分选的细胞(血液肿瘤)。如果必须采用显微切割

13、分离细胞,具体需要多少细胞还不确定，需进一步明确。8. 虽然需要提取多种大分子,但首先考虑提取高质量的DNA.同样能够提取高质量的RNA。样本处理全血标本血清的分离是临床样本收集中的一项重要内容，所得血清可用来直接检测样本中肿瘤抗原和（或）抗体；分析血清中某种标志物以及相关蛋白表达，进行细胞因子以及DNA和蛋白质的定性和定量分析。临床肿瘤标本库主要采集接受肿瘤外科手术患者之全血标本，采集分为术前、术后两部分。（1）术前血 指临床诊断明确，患者未经任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等，已接受上述治疗的患者样本需详细注明。（2）术后血 指接受手术后2周，患者未接受任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等。

14、采集血清操作时要严格注意安全防护，避免对人、环境造成污染，需认真注意以下事项：1）人员要求：操作时应戴手套以及眼睛和粘膜的保护装置。只有经过严格培训的技术人员才能进行这项工作。2）实验操作技术要求：规范的操作可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。3）移液管使用后应完全浸入适当的消毒液总。移液管应在消毒液中浸泡适当的时间，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。4）带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后应防止在适当的防漏容器内高压蒸汽灭菌和（或）焚烧。5）应备有适当的消毒剂来清洗喷溅和溢出标本。步骤（1）取血液标本，每例采集10mL（不少于5mL），ACD（

15、构橼酸盐葡萄糖抗凝剂）抗凝（或肝素、EDTA，首选ACD，其次EDTA），用于细胞培养的血液标本，室温保存；准备DNA提取的血液标本，4保存。约10mL全血分装入红帽管（不含抗凝剂）和紫帽管（含2%EDTA抗凝剂）中。（2）红帽管用于分离血清，室温放置30min后离心。紫帽管用于分离血浆。（3）尽快离心（30min内）。此时悬液分为三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在红细胞层上呈灰白色的白细胞层为外周血淋巴细胞。（4）轻轻吸取淡黄色血浆上层液放入1.5mL离心管中，每管100L，共9管，余液放入1管中。做好标记，P代表血浆，S代表血清。（5）编号后放入-80低温冰箱保存。组织组织样本可立即

16、固定，备病例诊断用；或分割后，采取不同方式进行保存。样本DNA、RNA的提取按常规实验方法提取肿瘤组织和癌旁、正常组织的基因组DNA、总RNA。石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。新鲜组织块的处理步骤首先用生理盐水洗两次，然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀，离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。3组织芯片制备组织芯片制作流程包括：阵列设计、入选样本病理复诊与标记、取芯（供体蜡块）、点阵（受体蜡块、切片制成组织芯片）：1）检测芯片：主要用于检测标志蛋白表达状况和水平，可以使用具有明确临床病理学资料但随访时间短或无患者生存期的组织标本

17、制备。2）分型芯片：在用于检测标志蛋白表达状况和水平的基础上，能够用于临床分子分型研究和评价。所用的组织要求有系统的临床随访和生存期资料，这是一个关键问题。样本保存1.采集的生物样本分装、标记和保存是十分重要的，有些样本要在几年或更长的时间以后才会用于实验研究，因此质量监控和检索的方便尤为关键。要保证实验样本的质量和数量能够在若干年后用于DNA、RNA 和蛋白质提取和实验分析。2. 所有生物样本应分装贮存，尽量避免多次反复解冻。长期保存样本的最适保存条件为在液氮或-135保存。3. 生物样本的容器应采用螺口的冻存管，能够在低温下长期储存，玻璃管或弹出式盖子的管子不适合长期储存。标本储存分为组织

18、标本保存和提取物保存两大类。1.组织标本保存（1）新鲜标本：可用来保存新鲜标本的实验体系包括：细胞培养液、缓冲液如磷酸盐缓冲液（PBS）、核酸保护剂（如RNA laterTM）中，或直接做干燥处理，或于室温保存或置于冰浴中。组织标本可在切割后的24h内转送到研究者的实验室中。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体做法是，先用生理盐水将组织洗1次，切成宽度1cm的小片，加入适量的生理盐水，然后，边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%。这样固定的组织标本室温下可保存数日，4可保存6年。（2）冻存标本：标本冻存管可直接冻存于液氮，再转移到-70冰箱，或OCT包埋后储存于液氮或-70。标本在运送过程中，可

19、将其置于冰中保存。（3）石蜡固定标本：采用石蜡包埋，蜡块编号，分类存放。定期整理液氮保存样本，移入-80低温冰箱内长期保存。2.血清样本保存编号后分装、低温冻存，可置于-20、-70冰箱或液氮罐中。有研究表明，用于RNA测定，最好是使用EDTA抗凝（严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制作用，且很难再核酸提取过程中完全去除）全血标本，抗凝后6h内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快（2h内）分离血清，标本的短期（1-2周）保存可在-20下，较长期保存应在-70下。3.体液标本临床体液标本包括胸腔积液、腹水、脑脊液、尿液等，可按水样标本的方式离心去沉淀后，提取核酸。临床体液标本长期（超过2周）保存应

20、在-70下。4.提取物保存按常规实验方法提取肿瘤组织和癌旁、正常组织的基因组DNA、总RNA。定量后分装提取的核酸，保证每份标本可供五个研究者使用，具备50-100次核酸研究用量，并保存使用记录。由于靶核酸（尤其是RNA）易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。检测靶核酸为DNA的标本，可在2-8下保存3d，也可于10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA（pH7.5-8.0）缓冲液中4下保存。而检测靶核酸为RNA的标本，一旦采集送到实验室后，则应在-20以下冻存。为使临床标本中可能存在的核酸酶失活，可加入chaotropic物质，最常用的是4mo

21、l/L异硫氰酸胍盐（Guanidinium isothiocyanate，GITC），并同时与还原剂如-巯基乙醇或二巯基乙醇一起使用。使用终浓度为5mol/L的GITC，可使RNase不可逆的失活，如浓度4mol/L则失去对RNase的抑制作用，而使RNA迅速降解。使用GITC作为稳定剂保存靶核酸为RNA的标本，标本可在室温下稳定约7d。此外，如测定的靶核酸为血循环中的RNA，为避免室温放置过久而致RNA的降解，最好不要使用血清标本，而应使用EDTA抗凝后尽快分离后的血浆标本。临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为RNA，则可稳定数周。研究表明，保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。标本加于滤纸片上，对于标本的室温运送非常方便，适用于特定病原体的分子流