保护碱基添加总结

1、酶切位点保护碱基表6 酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrPvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA0 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA0 500 90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT10 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG

2、 CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA0 0 10 9010 10 50 90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG10 10 0 090 90 50 50酶切位点保护碱基表2关键词： 酶切位点保护碱基表2 酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrNot ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA0 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi

3、 ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10 9090 90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG0 0 00 25 90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG0 0 0 750 25 50 90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0 10 90 90 00 10 90 9

4、0 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA0 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA0 500 90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT10 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA0 0

5、10 9010 10 50 90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG10 10 0 090 90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT0 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT90 90 9090 90 90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG0 90 75 750 90 90 90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGA

6、GCGG0 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA0 25 50 900 75 90 90酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG000000Afl IIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG0909009090Asc IGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA909090909090Ava ICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA509090909090BamH ICG

7、GATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCG109090259090Bgl IICAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCC0752509090BssH IIGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA00500090BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0252505090Cla ICATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050Eco

8、R IGGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGG909090909090Hae IIIGGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCAA909090909090Hind IIICAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGG00100075Kpn IGGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCG0909009090Mlu IGACGCGTCCGACGCGTCG025050Nco ICCCATGGGCATGCCATGGCATG050075PCR引物设计原则信息来源：本站原创更新时间：2004-12-21 0:44:00 PCR引物设计的目的是

9、为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，

10、一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。这里还需提醒的是3端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 产物不能形成二级结构。 引物长度一般在1530碱基之间。 G+C含量在40%60%之间。 碱基要随机分布。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 引物之间不能有连续4个碱基的

11、互补。 引物5端可以修饰。 引物3端不可修饰。 引物3端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（

12、G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3.长度寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。4.G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm

13、为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二

14、级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四种dNTP各200mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。AA错配使产量下降至1/20，AG和CC错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加

15、酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。 PCR参数设定的基本原则 PCR知识 一个PCR反应开始，首先是双链DNA解离为单链，使之有利于与引物结合过程可以通过加热来完成。在9095条件下，即使复杂的DNA分子，如人基因组DNA也可变性成单链，根据模板DNA复杂程

16、度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94C、30s可使各种复杂DNA分子完全变性。过高温度或持续时间过长，对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都会造成损害。变性后的DNA很快冷却至4060，即可使引物和模板DNA发生结合。这是由于模板DNA结构比引物复杂得多，引物和模板之间碰撞的机会大大高于模板互补链之间的碰撞。复性温度的选择，可以根据引物的长度和其G-+-C含量确定。引物长度为1525bp时，退火温度可通过Tm4X(G+C)+2X (Ad-T)计算得到。在Tm允许的温度范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR的特异性。退火时间设置为30s，足以使引物和模板之间完全结合。PCR反应的延伸温度为7075，此时，TaqDNA聚合酶具有最高活性。引物在16个核苷酸以下时，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。可采用反应温度缓慢升高到7075的