电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、电泳技术第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术第二节常见电泳技术一二三纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳四五琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳六七八九等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE

2、PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。1、聚丙烯酰胺凝胶的特点可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点更高的灵敏度：1091012 mol/L化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”电泳分离的重复性好透明度好，便于照相和复印机械强度好，有弹性，便于操作和保存无紫外吸收可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP)或 核黄素（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和B

3、is总浓度)（%）=C(交联剂百分比)（%）=a + bmba + b100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b10a/b100a/b=30凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.50.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr2%，Bis0.5%，凝胶就不能聚合。当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。T为2%-5%T为5%-10%T为15%-20%a/b=20左右a/b=40左右a/b=125-200左右凝胶浓度与孔径的关系T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大

4、。孔径还同Acr与Bis的比例有关，Bis占Acr总浓度5%时，孔径最小。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在330之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径高浓度凝胶具有较小的孔径凝胶浓度与被分离物相对分子量的关系分离胶浓度（%）20301520101551025蛋白质相对分子量500KD3、影响凝胶聚合的因素Acr及Bis纯度AP核黄素TEMEDpH分析纯；pH值为4.9-5.2；4避光贮存聚合在40-60min内完成碱性条件下聚合较快，但碱性过强时胶硬而脆3、影响凝胶聚合的因素温度氧分子一般25-35聚合凝胶先抽真空脱气，再加引发剂4、PAGE

5、原理有无浓缩效应连续系统电荷效应分子筛效应不连续系统电荷效应分子筛效应浓缩效应不连续体系电极缓冲液样品胶浓缩胶分离胶样品胶T=3%,c=2%，其中含有一定量的样品及pH6.7的Tris-HCl缓冲液，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。直接在样品液中加入等体积40%蔗糖。浓缩胶浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及pH值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。分离胶分离胶的T=7.0%-7.5%,c=2.5%，缓冲液为pH8.9的 Tris-HCl，大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷。此胶主要起分子筛作用。（1）样品浓缩效应缓冲体系离子成分及

6、pH值的不连续性凝胶孔径的不连续性电位梯度的不连续性电极缓冲液pH8.3 Gly-Gly-sample缓冲体系离子成分及pH值的不连续性HCl在任何pH溶液中均易解离出(Cl-)，在电场中迁移率Cl-浓缩胶pH6.7快，走在最前面称为快离子。甘氨酸pI=6.0，在pH8.3的Gly-sampleCl-分离胶pH8.9电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2 CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，称为慢离子。大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩

7、成为极窄的区带。sample凝胶孔径的不连续性浓缩胶为大孔胶在电场作用下，样sample分离胶为小孔胶品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。sampleCl- Cl- Cl- Cl-电位梯度的不连续性低电导区，使局部电位梯度增高sample电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。（2）分子筛效应大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。蛋白质进入pH8.9的同一孔

8、径的分离胶后，分子小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。（3）电荷效应在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。不连续PAGE原理总结缓冲体系离子成分不连续性四个“不连续性”促 “浓缩”pH值的不连续性电位梯度的不连续性凝胶孔径的不连续性不连续PAGE原理总结

9、电荷效应分子筛效应电荷效应两个“效应”促 “分离”分子筛效应连续PAGEPAGE连续体系虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的分离，加之在温和的pH条件下，不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优越性。三、SDSPAGE1、原理SDS-PAGE的基本原理与PAGE的原理相同，不同之处在于：在SDS-PAGE中，样品介质和聚丙烯酰胺中添加了离子去污剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）和强还原剂（如巯基乙醇）。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子大小，而电荷电荷因素可以忽略。（1）SDSSDS即十二烷基磺酸钠，是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团

10、的混合形式存在，单体和分子团的浓度与SDS总浓度、离子强度及温度有关。断裂分子内或分子间氢键阴离子去污剂助溶剂分子内去折叠变性剂破坏蛋白质分子的二、三级结构在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS单体能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4gSDS/g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4gSDS/g蛋白质。（2）巯基乙醇：使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS：使变性的蛋白质分子带有大量的负电荷。复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物

11、的短轴相同，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比。SDS-PAGE测定蛋白相对分子质量的原理巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDS使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变，同时使变性蛋白分子带上大量的负电荷。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开。SDS-PAGE基本原理视频资料2、影响迁移率的因素二硫键是否完全被还原只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋

12、白质分子上去，并使之具有相同的构象。溶液中SDS的浓度溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。溶液的离子强度溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。3、应用蛋白质的分离纯化蛋白质纯度的检测蛋白质分子量的测定SDS-PAGE分析Bt菌株W015-1的晶体蛋白1-9分别为菌株培养生长4h、16h、18h、20h、22h、26h、30h、34h和48h后产生蛋白的情况蛋白质相对分子质量的测

13、定（1）绘制标准曲线量出各蛋白质样品和溴酚蓝区带中心与加样端的距离（cm），按下式计算相对迁移率MR：相对迁移率MR =蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)加样位置蛋白makerb溴酚蓝ac标准蛋白MR= b/a样品蛋白MR= c/a由已知分子量的标准蛋白质系列的电泳分离结果可得各种标准蛋白的相对迁移率。MW=K（10b MR）MW为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；MR为相对迁移率。以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量对数为纵坐标作图，可得到一条标准曲线。lgMW=lgKb MR =K1bMR式中：MW为蛋白质的分子量；K，K1为常数；b为斜率

14、；MR为相对迁移率。（2）样品分子量的计算根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。4、注意事项有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。SDS-PAGE基本操作过程视频资料5、SDS-PAGE常见问题及措施凝胶不凝主要原因：试剂方面主要

15、措施：保证试剂的纯度、配制无误、操作过程准确分辨率不高主要原因：聚丙烯酰胺的未充分聚合主要措施：待凝胶在室温凝固后，在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。“微笑”形带主要原因：凝胶的中间部分凝固不均匀；上样体积过大导致不完全堆积；温度过高等。主要措施：待胶充分凝固；减小上样体积；降低温度。“皱眉”形带主要原因：两板之间的底部间隙气泡未排除干净。主要措施：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。带出现拖尾现象主要原因：样品融解效果不佳或分离胶浓度过大。主要措施：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。带出现纹理现象主要原因：样品不溶性颗粒引起。主要措施：加样前离心；加适量样品促溶剂。出现“鬼带”主要原因：还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性。主要措施：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋