定量PCR中_ct值的含义-pcrct值;

1、实时荧光定量pcr 实时荧光定量pcr技术于1996年由美国applied biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了pcr从定性到定量的飞跃，而且与常规pcr相比，它具有特异性更强、有效解决pcr污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。 一. 实时荧光定量pcr原理所谓实时荧光定量pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1. ct 值的定义在荧光定量pcr技术中，有一个很重要的概念 ct值。c代表cycle，t代表threshold，ct

2、值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。图1. ct值的确定 2. 荧光域值（threshold）的设定pcr反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 sdcycle 6-15 3. ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系1，起始拷贝数越多，ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算

3、出该样品的起始拷贝数。图2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料2。现将其原理简述如下：1） taqman荧光探针：pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。如图3所示。图3. taqman 荧光探

4、针工作原理2）sybr荧光染料：在pcr反应体系中，加入过量sybr荧光染料，sybr荧光染料特异性地掺入dna双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的sybr染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步。二内标在传统定量中的意义1几种传统定量pcr方法简介3：1）内参照法：在不同的pcr反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在pcr产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板4。2）竞争法：选择由突

5、变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化pcr产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数5。3）pcrelisa法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的pcrelisa法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的6。2内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是

6、终点检测，即pcr到达平台期后进行检测，而pcr经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔pcr仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。图4. 相同模板在同一台pcr仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；ct值则极具重现性三内标对荧光定量pcr的影响 1实时荧光定量pcr无需内标实时荧光定量pcr技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软

7、件之中，通过对每个样品ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量pcr无需内标是建立在两个基础之上的：1）ct值的重现性pcr循环在到达ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的ct值是恒定的。（见图4）2）ct值与起始模板的线性关系由于ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量pcr是一种采用外标准曲线定量的方法。2内标对实时荧光定量pcr的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则pcr反应变为双重pcr，双

8、重pcr反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著7,8。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方9。applied biosystems公司的7700型实时荧光定量pcr仪是全球公认的荧光定量pcr的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲

9、线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量pcr是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域10,11,12,13。参考文献1. higuchi r, fockler c, etal. kinetic pcr analysis: real-time monitoring of dna amplification reactions. biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.2. dna/rna real-time quantitative pcr

10、-rev. b applied biosystems 3. 定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用. 中华检验医学杂志2000, 23(2): 120-121.4. anderson km, cheung ph, kell md. rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger rna by competitive polymerase chain reaction. j pharmacol toxicol methods, 1997, 38

11、: 133-140.5. wuhu a, waiztu m, koch a. a rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase (crt) pcr analysis of cellular genes. brain pathol, 1998, 8: 13-186. 仝文斌，高巍，费然等. 核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法. 中华医学检验杂志，1999, 22: 83-86.7. actor jk, limor jr, hunter rl. a flexible bioluminescent-quant

12、itive polymerase reaction assay for analysis of competitive pcr amplicons. j clin lab anal, 1999, 13(1): 40-47.8. schnell s, mendoza c. enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(qc-pcr). j theor biol, 1997, 184(4): 433-440.9.

13、 ke ld, chen z, yung wk. a reliability test of standard-based quantitative pcr: exogenous vs endogenous standards. mol. cell probes, 2000, 14(2): 127-135.10. becker k., d. pan and c.b.whitely. real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. hum. gene ther, 1999, 10: 2559-25

14、66.11. higgis, j.a., etal. 5 nuclease pcr assay to detect yersinia pesits. j clin microbiol, 1998, 36: 2284-2288.12. bieche i., p.oondy, etal. real-time reverse transcription-pcr assay for future nagement of erbb2-based clinical apolications. clin.chem, 1999, 45: 1148-1156.13. wang x. x. li, etal. a

15、pplication of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mrna in ischemic brain tolerance. 2000,neurosci.res, 59(2): 238-46.荧光定量pcr中基线、阈值、ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线（baseline）：是指在pcr扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光域值（threshold）的设定：一般将 pcr反应前 15个循环的荧光

16、信号作为荧光本底信号，荧光域值是pcr第315个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在 pcr扩增的指数期。ct值：表示每个pcr反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表ct值。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线pcr过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线 判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：1、曲线拐点清楚，特别是低浓度