发酵与酿造工程学基础及主要设备.ppt

1、第四章 发酵与酿造工程学基础及主要设备,第一节 发酵与酿造的工艺过程,一、菌种活化与扩大培养,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的概念:,种子扩大培养的目的与要求,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,（一） 种子制备的技术概要,1.种子制备的过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床

2、等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,2. 实验室阶段,接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接入斜面/平板，进行活化。(两次转接),A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化,可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。 举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，耍注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10以下，冰箱保存备用

3、。,B、产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种,可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。,C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32，培养18-24 h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32 培养12 h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。,D、不产孢子的细菌,一般保存在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基的斜面上，4冰箱保存.每年移种3-4次。 斜面菌种接入含10mL麦芽汁试管25-27培养2-3d扩大至三角瓶25培养2d移至含5-10L麦芽汁的罐15-20培养3-5d含

4、100L麦芽汁的发酵罐。,E、生产啤酒的酵母菌,MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨, 10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。,3.生产车间阶段,采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,种子罐培养原则：,摇瓶菌丝体种子： 种子罐之间或发酵罐间的移种：,接种方法：,可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。,主要采用压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零。,生产车间种子制备工艺可控参数:,种子罐级数,种龄,接种量,A 种子罐级数的确定,种子罐级数指制备种子

5、需扩大培养的次数.,种子罐级数的意义： 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜过少。,种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件有关。 优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可减少种子罐的级数。,（1）生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。 例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32培养7一10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。,（2）生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。 例如：青霉素孢子悬液接

6、入一级种子罐（发芽罐）于27培养40h，孢子发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），27培养10-24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,（3）生长更慢的菌种 链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养。 在小型发酵罐(5-30L)进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。,接种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 接种龄以菌丝处于对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。 过于年轻的种子：前期生长缓慢、发酵周期延长、产物形成推

7、迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。 过老的种子：会引起生产能力下降，菌丝过早自溶。 不同品种或同一品种的工艺条件不同，接种龄是不一样的，要经试验，确定最适接种龄。,B 接种龄,移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量大小决定于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。,例如：抗生素发酵的最适接种量为7-15，有时可增加到20-25。而谷氨酸发酵只需1。,C.接种量,大接种量： 可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前，且生产菌迅速繁殖，可减少杂菌生长机会。 原因：? (a、种子量多 b、种子液含大量水解酶类，利于利用基质),接种量过多： 往往使菌丝生长过

8、快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。,嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶： 1接种量产酶活力最高，超过4酶产量明显下降。,接种量过小： 除了延长发酵周期外，往往还会引起其他不正常情况。 例如：在头孢菌素生产中，由于接种量过小，会产生大量菌丝团，而使产量降低， 但有的抗生素如制霉菌素，用1接种量比用10接种量的效果好，而0.1接种量与1的效果相似。,近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。 双种法：有的产品采用二只种子罐接一只发酵罐，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8，而且达到产量高峰的时间提前。 倒种法：即以适宜的发酵液倒出适量，给另一发酵罐作种

9、子例如链霉素发酵中，使用倒种法比单种的发酵单位提高12。而四环素发酵采用双种效果并不显著。,(1)原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。(什么引起原料质量波动?),A.影响种子质量的因素,原材料质量的波动，起主要作用的是无机离子含量不同，如微量元素镁、铜、钡能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,4. 种子质量的控制,例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。 例2：制备霉菌用的大(小)米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。 例3：蛋白胨加工原料

10、不同，对孢子影响也不同。 例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子质量的变化。 例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。,(2)培养条件 温度 对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。 例如：土霉素生产菌种在高于37培养时，孢子接入发酵罐后，表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。,湿度 斜面培养基湿度对孢子数量和质量有较大影响。 例如：土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现： 北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含少量水分的试管斜面下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。 在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多

11、而不利于孢子形成。, 通气量 种子罐有足够的通气量可以提高种子质量。 例如: 青霉素生产，将通气充足和不足情况下得到的种子分别接入发酵罐，发酵单位相差1倍。 但也有例外 例如：土霉素生产中，一级种子罐的通气量小对发酵有利。,(3)斜面冷藏时间 例如：土霉素生产菌种，孢子斜面培养4d即于4冰箱保存，冷藏7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。,例如：链霉素生产中，斜面孢子在6冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18。,斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。,冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。,为保证种子质量，除保证培养条件外，还要定期取样测定一些参数，以观察基质的

12、代谢变化及菌丝形态是否正常。,1).pH 2).培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量 3).菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等) 4).其他参数，如接种前抗生素含量、某种酶活力等,B.种子质量的判断,测定的参数:,用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试： 例如：土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。淀粉酶活力高的，接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。,（1）菌种稳定性的检查 生产菌种，必须保持稳定的生产能力，虽然菌种保藏在休眠状态的环境中，但微生物或多或少会出现变异的危险，因此定期考察及挑选稳定菌种十分重要。 方法：取少许菌种，逐级稀释，划线培养。挑出形态整齐、孢子

13、丰满的菌落，摇瓶试验，测定生产能力。,C.种子质量的控制,（2）无(杂)菌检查 种子制备过程中，每移种一步，均需进行杂菌检查。 方法：镜检、肉汤或平板培养、种子液生化分析。 生化分析项目：营养消耗的速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味有否异常等。,（二） 种子制备过程举例,1.谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,（1）斜面 (AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不

14、超过3次,（2） 一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基,（3） 二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)）， 32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2

15、活力旺盛,2.青霉素生产的种子制备,制备过程,安培管, 斜面孢子, 大米孢子, 一级种子, 二级种子, 发酵,（1）斜面孢子,培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天, 注意湿度50%左右,（2）大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*10个孢子,（3）一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,

16、（4）二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少。,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,二、发酵与酿造原料前处理及培养基的制备,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长 促进产物的形成,发酵培养基的要求, 培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，

17、适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。,（一） 培养基的类型及功能,培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型,1.按纯度,合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产,天然培养基: 采用天然原料,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4

18、.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10, pH 7.0,YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2,培养大肠杆菌常用两种培养基,2.按状态,固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产,半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。,液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,3.按用途（从发酵生产应用考虑） 培养基按其用途可分为孢子

19、（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种,（二） 发酵培养基的成分及来源,1.碳源,（1）作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分,（2）来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,（3）工业上常用的糖类, 葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标, 糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的

20、影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐, 淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、 发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格低 难利用，可以解除葡萄糖效应,例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响,碳源 细胞量 -淀粉酶 葡萄糖 4.2 0 蔗糖 4.02 0 糊精 3.06 38.2 淀粉 3.09 40.

21、2,2.氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,（1）无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之为迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生

22、理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义： 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,（2）有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。,例 玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动

23、对发酵的影响,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例： 蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题,3.无机盐的微量元素,作用：各种不一样,来源：C、N源，以盐的形式补充,用量：根据具体的产品，以实验决定,使用注意点：,例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶， pH对酶活的影响 pH

24、 酶活 不加 4.25 120分钟 加 K2HPO4 5.45 30分钟 加 KH2PO4 4.62 75分钟,A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,（2）前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,4.生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,（1）生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生

25、物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,作用：前体有助于提高产量和组份,用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38% 实际使用时的转化率在46-90%之间,用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体

26、相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前体的转化率,（3）产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,5.水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,（三） 最佳培养基的确定,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,1.培养基成分选择的原则,菌种的同化能力,代谢的阻遏和诱导,合适的C、N比,pH的要求,（1）理论转化